原发性肝癌患者外周血GPC-3 mRNA的表达与微转移的关系柏凯

作者：梁平

 
   【关键词】  肝癌患

   【摘要】目的 探讨原发性肝细胞癌（HCC）患者外周血的Glypican-3（GPC-3）mRNA检测用于诊断HCC早期微转移的可行性。方法 采用巢式逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测39例原发性肝细胞癌（HCC）、19例肝炎和肝硬化、10例转移性肝癌、10例肝血管瘤患者、19例健康献血员外周血GPC-3 mRNA水平。结果 HCC患者外周血中， GPC-3 mRNA的检出率为62%（24/39），GPC-3 mRNA 的检出率与肿瘤直径77%（17/22）、癌结节数目67%（19/24）、临床TNM分期76%（19/25）、门静脉癌栓90%（9/10）、远处转移100%（6/6）等临床参数密切相关。GPC-3 mRNA在转移性肝癌、肝炎和肝硬化、肝血管瘤患者及健康献血员外周血中均未检出。结论 巢式RT-PCR检测HCC患者外周血单核细胞GPC-3 mRNA是一种早期发现原发性肝细胞癌血道播散的可靠而又敏感的实验方法。

    【关键词】 肝细胞癌;GPC-3;巢式RT-PCR;微转移

    Relationship between the expression of GPC-3 mRNA in peripheral blood and tumor micrometastasis in patients with primary hepatocellular carcinomaBo Kai， Liang Ping. Department of Hepatobiliary Surgery， Xinqiao Hospital， Third Military Medical University， Chongqing 400037， China【Abstract】 ObjectiveTo explore the feasibility of Glypican-3 （GPC-3） mRNA as a marker of mi-crometastasis in peripheral blood of patients with hepatocellular carcinoma （HCC）. MethodsSubjects GPC-3 mRNA in peripheral blood were detected by nested reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） in 39 patients with HCC， 19 hepatitis B and liver cirrhosis， 10 the metastatic liver cancer， 10 hepatic hemangioma， and 19 healthy volunteers. ResultsGPC-3 mRNA was positive in the peripheral blood in 24patients with HCC （62%）， and negative in patients with hepatitis and cirrhosis，hemangio-ma， metastatic liver cancer and healthy volunteers. The expression of GPC-3 mRNA was strongly corre-lated with tumor diameter， portal thrombosis， metastasia and TNM stage （ P <0.05）. ConclusionsNested RT-PCR is a sensitive and reliable method for detecting circulating HCC cells.

    【Key words】HCC; GPC-3; nested RT-PCR; micro-metastasis

    早期微转移是原发性肝癌（HCC）难以有效诊治和病死率高的主要原因之一，因此早期检测出外周血中的肿瘤细胞，对及早有效的综合治疗具有重要的临床意义。血液微转移是HCC的主要转移途径［1］，但血液微转移的诊断仍然存在困难，主要是没有找到能准确反映微转移的肿瘤分子标记物。近年来发现Glypican-3（GPC-3）与肝癌的发生发展有密切的关系［2］。本研究对HCC患者的外周血进行巢式RT-PCR检测，探讨GPC-3 mRNA检作者单位: 400037 重庆，第三军医大学新桥医院肝胆外科测对肝细胞癌微转移诊断的可行性。

    1 材料与方法

    1.1研究对象2004年3月至2005年12月，第三军医大学新桥医院及西南医院诊治的HCC患者39例、肝炎和肝硬化19例、转移性肝癌患者10例、肝血管瘤患者10例、健康献血员19例。各类患者的诊断均经组织病理学或影像学检查证实，实验操作同期进行。39例HCC患者中， 男性33例， 女性6例， 年龄30～72岁，平均（49±12）岁;其中TNM（国际抗癌联盟第6版TNM分期标准）Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期分别为5例（13%）、9例（23%）、19例（39%）、6例（15%）;伴门静脉癌栓10例（25%）;伴肝外转移6例（16%）;肿瘤直径≥5 cm者22例（55%）;癌结节2个以上者24例（62%）;分化程度高、中、低者分别为6例（32%）、7例（36%）、6例（32%）;血清AFP≥31 μg/L者25例（69%）。肝外转移灶的诊断依据X线、CT或彩色超声检查。转移性肝癌的原发灶分别是直肠癌（4例）、结肠癌（3例）、胃癌（2例）和胆管癌（1例）。其中4例经过组织病理学检查证实，其余6例根据影像学及其血清学检查确诊。10例肝血管瘤诊断均经组织病理学证实。

    1.2 方法1.2.1标本采集采集受检者EDTA抗凝血5 ml。

    1.2.2单核细胞分离采用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离外周血单核细胞。

    1.2.3细胞总RNA提取以Trizol采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步提取有核细胞总mRNA，经紫外分光光度计和变性胶电泳鉴定，证明制备RNA的纯度及未被降解。

    1.2.4cDNA合成3 μg RNA样本加入20 μl cDNA反应体系，参考美国Promega公司产品说明书进行cDNA合成。

    1.2.5PCR扩增GPC-3 mRNA时的一级PCR反应体系（50 μl）:5μl cDNA模板、5 μl 10×缓冲液、4μl MgSO4 、4 μl dNTP、两条外引物各10 pmol、5 U Taq DNA聚合酶等。循环参数:94 ℃ 3 min→94 ℃ 30 s→57 ℃ 30 s→72 ℃ 1 min，30个循环，68 ℃延伸7 min;取出5 μl反应产物，加入内引物，继续进行第二级PCR反应。反应体系同上，循环参数同上，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。扩增GPC-3外引物:上游引物:5'-AGACT-GCGGTGATGATGAAGAT-3'，下游引物:5'-GAGAACGATAGAAAGGGAGGGA-3';GPC-3内引物:上游引物:5'-AACTCCGAAGGACAA-CGAGA-3'，下游引物:5'-CTATGTTTGGCTGCT-AGAAC-3'，产物全长402 bp。扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳30 min，通过凝胶成像分析仪观察并摄像。

    1.3统计学处理相关数据均应用SPSS统计学软件处理， P <0.05差异有统计学意义。

    2 结果

    2.1外周血单核细胞GPC-3 mRNA的表达39例HCC患者外周血中GPC-3 mRNA检出率为62%（24/39），在转移性肝癌、肝炎肝硬化、肝血管瘤患者及健康献血员的外周血中均未检出GPC-3 mRNA，见图1。图1 肝细胞癌患者外周血标志物检测结果 M:DNA标志物;1:肝炎和肝硬化患者;2:原发性肝细胞癌患者;3:肝血管瘤患者;4:转移性肝癌患者;5:健康献血员2.2HCC患者临床参数与GPC-3 mRNA表达将39例HCC患者按肿瘤直径、癌结节数目、分化程度、临床TNM分期、门静脉癌栓及肝外转移分组，其GPC-3 mRNA的阳性检测率见表1。由表1可见，原发性肝细胞癌患者外周血GPC-3 mRNA检出率与肿瘤直径、癌结节数目、临床TNM分期、门静脉癌栓、远处转移明显相关（ P <0.05），而与血清AFP水平、分化程度等无相关（ P >0.05）。表1 HCC患者外周血GPC-3 mRNA阳性率与各临床参数

    3 讨论

    肿瘤转移是影响HCC患者预后的重要因素，也是HCC治疗失败的主要原因之一，而血行播散是其转移的重要途径，检测外周血中有无肿瘤细胞对判断是否有血行播散具有重要意义。近年来，国外有学者检测血液中有肿瘤细胞特异性mRNA，并用后者以间接的方式推测肿瘤细胞发生转移［3］。在血液中存在大量RNA酶的状况下，肿瘤细胞被溶解破坏所释放的肿瘤细胞特异性mRNA不可能存在或被立即破坏，但肿瘤细胞胞膜完整时，胞内的特异性mRNA未被破坏，因此可用肿瘤细胞特异性mRNA作为肝细胞癌的标志基因，从血液中检测到肿瘤细胞特异性mRNA可以判断其来自于血液中播散的肝癌细胞［4］。近年来，GPC-3被认为是原发性肝细胞癌表达的比较特有的基因。GPC-3 mRNA在胃癌、乙状结肠癌、结肠恶性间皮瘤及子宫肌瘤中均不表达，在成人正常组织如肝、肺、肾、心、脑、脾、胃、 小肠、大肠、睾丸、膀胱及胰腺中亦均不表达 ［5-6］。 Zhu等 ［7］应用Northernblotting分析和原位杂交技术证实GPC-3 mRNA在正常肝组织、肝灶性结节状 增生、肝硬化中低表达或不表达;相反在研究的30例HCC患者中有20例显著表达，在5例中适度表达;GPC-3 mRNA在HCC中相对于在正常肝组织 中的表达平均增加有显著意义（增加21.7倍， P < 0.01）。GPC-3被认为是HCC早期的敏感标记物。 本实验通过检测原发性肝癌患者外周血GPC-3 mRNA，分析其与患者临床参数如肿瘤直径、癌结节数目、分化程度、临床TNM分期、门静脉癌栓及肝外转移等的相关性，探讨外周血GPC-3 mRNA检出与原发性肝癌微转移的关系。结果我们发现外周血GPC-3 mRNA检出率与肿瘤直径、癌结节数目、临床TNM分期、门静脉癌栓、肝外转移明显相关（ P <0.05）。Ⅰ、Ⅱ期患者阳性率36% （5/14） 远较Ⅲ、Ⅳ期患者阳性率76%（19/25）低（ P <0.05），说明原发性肝癌早期即表现为全身性疾病，可以发生肿瘤细胞的血源性播散。随着临床分期的增加，外周血单核细胞GPC-3 mRNA检 出率有增高的趋势，提示动态观察外周血中GPC-3 mRNA 表达有助于判断原发性肝癌患者的预后。这一现象和Nakano［8］等报道的即使直径<2 cm的高分化肝细胞癌，肿瘤细胞也可能侵蚀血管壁形成血道微转移的结果基本相符。GPC-3 mRNA在门静脉癌栓的患者中表达高达90%（9/10），肝外转移患者的外周血单核细胞GPC-3 mRNA 100%（6/6）阳性，表明随着肿瘤逐渐进展，发生转移的可能性增大。提示外周血中检测到的GPC-3 mRNA 与原发性肝癌的进展密切相关，外周血细胞GPC-3 mRNA检测对估计肝癌有无血行播散与肝外转移有重要价值，可作为判断原发性肝癌患者预后及有无血道播散的重要指标，有望成为判断肝癌血行微转移的一项有用的预测指标。

    参考文献

    ［1］唐浩，梁平.外周血GPC-3 mRNA在大鼠肝癌微转移中的意义［J］.消化外科，2005，4（1）:48-51.［2］ Hsu H C， Cheng W， Lai P L. Cloning and expres-sion of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: boological s ignificance and temporospatial distribution［J］. Cancer Res，1997，57（22）:5179-5184.［3］ Komeda T， Fukuda Y， Sando T， et al . Sensitive de-tectin of circulating hepatocellular carcinoma cells in peripheral venous blood［J］. Cancer，1995，75（9）:2214-2219.［4］ 徐胜军，胡炳奎，凌志强，等.AFP mRNA检测外周血游离癌细胞预测肝癌微转移的初步评价［J］.浙江实用医学，2003，12，8（6）:333-335.［5］ 丁光辉，王红阳，陈汉，等.GPC-3 mRNA在甲胎蛋白阴性肝癌中的表达及其意义［J］.中华实验外科杂志，2001，3，18（2）:112-113.［6］ Yamataka A， Yamataka T， Kobayashi H， et al . Lack of C-KIT+ mast cells and evelopment of idio-pathic gastricperforation in neonates［J］. J Pediatr Surg，1999，34（1）:34-38.［7］ Zhu Z W， Friess H， Wang L， et al . Enhanced glypi- can-3 expression differentiates the majority of hepato-cellular carcinoma as from benign hepatic disorders［J］. Gut，2001，48（4）:558-564.［8］ Nakano M， Saito A， Yamamoto M， et al . Stromal and blood vessel wall invasion in well-differentiates hepatocellular carcinoma［J］. Liver，1997，17（1）:41-46.