幽门螺杆菌与原发性肝内胆管结石的关系

作者：李霆,孟翔凌

作者单位：230022 合肥，安徽医科大学第一附属医院普外科 
        【摘要】  目的 研究幽门螺杆菌(helicobacter pylori，Hp)与原发性肝内胆管结石(primary intrahepatic stones，PIS)之间的关系。方法 采用PCR法检测胆汁及肝内胆管黏膜组织中HpDNA；采用改良fishman法检测β葡萄糖醛酸苷酶(βGlucuronidase,βG)。结果 37例PIS患者胆汁及胆管黏膜行HpDNA PCR检测，总阳性数为26例(70.27%)，而对照组胆汁中HpDNA仅1例阳性，Hp感染率两组之间比较差异有统计学意义(P<0.01)。PIS患者有Hp感染者与无Hp感染者外源性βG比较无明显差异，然而内源性βG升高，具有统计学意义。结论 PIS与Hp感染相关，并且Hp可能通过内源性βG途径参与PIS的形成。

   【关键词】  幽门螺杆菌； β葡萄糖醛酸苷酶； 胆管结石

    Pathogenic mechanism of helicobacter pylori in primary intrahepatic stones  LI Ting, MENG Xiangling. Department of General Surgery, First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022, China

    【Abstract】  Objective  To study pathogenic mechanism of helicobacter pylori (Hp) infection in primary intrahepatic stones (PIS). Methods  Hp DNA in bile and mucosa of PIS samples was detected by PCR while activity of βglucuronidase (βG) measured by enzymological method. Results  PCR showed that 26 cases (70.27%) had positive HpDNA in bile and bile duct mucosa of 37 cases with PIS; but there was only 1 case with positive HpDNA in the control, with statistical significance upon infection rate of Hp between two groups (P<0.01). PIS cases included those infected with or without Hp. There was no statistical difference upon exogenous βG activity but statistical difference upon endogenous βG activity between positive Hp DNA and negative Hp DNA. Conclusion  PIS involves Hp infection agents that may accelerate formation of PIS by enhancing activity of endogenous βG activity.

    【Key words】  Helicobacter pylori;  βGlucuronidase;  Intrahepatic stones

    胆汁中幽门螺杆菌(helicobacter pylori,Hp)DNA的发现使得Hp与肝胆疾病的关系成为研究的热点［1-3］。但是，目前关于Hp与原发性肝内胆管结石(primary intrahepatic stones,PIS)之间的关系报道较少。为进一步探讨Hp与PIS之间可能存在的关系，我们设计本实验进行研究。

    1  材料与方法

    1.1  标本采集

    选取病例均排除肝硬化和肝癌等疾病。PIS组37例，其中男22例，女15例；平均年龄49.5岁(33～73岁)。17例为左肝内胆管结石，伴胆管炎者9例；8例为右肝内胆管结石，伴胆管炎者5例；左右肝内胆管结石者12例，伴胆管炎者6例。对照组8例，其中肝血管瘤2例， 胆道损伤1例， 壶腹部周围癌5例。开腹后穿刺抽取肝门部胆管胆汁1 ml立即送需氧、 厌氧和Hp培养， 另取2～3 ml胆汁置灭菌管内， 行肝叶切除者取肝组织及肝内胆管黏膜组织各约 0.5 cm×0.5 cm置灭菌管内， 标本均立即置-80 ℃冰箱保存。

    1.2  材料

    采用UreA引物，其核苷酸序列为：HpU1，5′CATCTCCCCCCCAACAAATC3′；HpU2，5′TTCACCACACGACCCATA3′，由上海生物工程公司合成和纯化。扩增产物长度为697 bp。βG测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。组织DNA抽提试剂盒购自中美合资优晶生物工程有限公司。

    1.3  方法

    1.3.1  细菌培养：胆汁和胆管黏膜即刻接种行厌氧菌、需氧菌及幽门螺杆菌培养。

    1.3.2  HpDNA的检测：(1)Hp阳性对照来源于胃癌手术患者胃黏膜组织(术前胃镜检查尿素酶实验强阳性)。(2)HpDNA的抽提：应用组织DNA抽提试剂盒提取胆汁和黏膜匀浆中DNA。(3)HpDNA PCR扩增反应：总反应体积为25 μl。其中模板量为1 μl，热启动Taq DNA聚合酶0.5 μl(5 U/μl)，10×PCR缓冲液2.5 μl，10 μmol/L上下游引物各为1 μl，10 mmol/L dNTP 2 μl，25 mmol/L MgCl2 2.5 μl，加无菌去离子水至25 μl。在DNA热循环仪(珠海黑马医学仪器有限公司)上，94 ℃预变性5 min，94 ℃变性50 s，50 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共40个循环，最后于72 ℃延伸10 min。(4)经1.2 %琼脂糖凝胶电泳后，紫外凝胶成像系统拍照、记录。

    1.3.3  βG的测定：应用南京建成生物公司的βG测定试剂盒进行检测， 根据试剂盒说明书进行操作， 分别测定内、 外源性βG。 酶单位定义为： 每毫克肝脏蛋白或每毫升胆汁在37 ℃条件下， 每分钟能催化生成1 μmol酚酞的酶量就是1个酶活力单位。

    1.4  统计学分析

    采用SPSS 11.0统计软件进行数据分析，定量资料组间比较采用ｔ验检，分类资料分析采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结果

    2.1  Hp检测结果

    37例PIS患者胆汁中均未培养出Hp。37例PIS患者行HpDNA PCR检测，胆汁中HpDNA阳性22例，胆管黏膜组织中HpDNA阳性13例，其中胆汁及胆管黏膜组织中HpDNA均阳性者9例，胆管黏膜组织HpDNA阳性而胆汁HpDNA阴性4例。PIS组HpDNA总阳性数为26例，对照组8例胆汁中HpDNA仅1例阳性。见图1、表1。

    1.Hp阳性对照； 2.胆管黏膜阳性结果； 3.胆汁阳性结果； 4.胆汁阴性对照由表1可知，PIS组较对照组HpDNA检测结果有差异，两组之间的Hp感染率比较差异有统计学意义(P<0.01)。

    2.2  βG检测结果

    表2和表3对βG检测结果按照其他普通细菌培养结果及HpDNA PCR结果进行分层检验，以排除其他普通细菌对βG检测结果的干扰。其他普通细菌培养阴性的患者中HpDNA阳性者与阴性者之间的内源性βG比较差异有统计学意义(P<0.01)， 然而外源性βG比较差异无统计学意义(P>0.05)；其他普通细菌培养阳性的患者中HpDNA阳性者与阴性者之间的内、外源性βG比较差异无统计学意义(P>0.05)。表2  HP对肝内胆管结石组胆汁βG的影响表3  HP对肝内胆管结石组肝组织βG的影响(±s，×103 U/mgprot)普通细菌培养阳性(n＝12)普通细菌培养阴性(n＝12)指标HpDNA阳性(n)HpDNA阴性(n)HpDNA阳性(n)HpDNA阴性(n)内源性βG7.528±0.485 (7)7.405±0.250 (5)7.627±0.409 (7)a5.457±0.205 (5)外源性βG1.556±0.150 (7)1.625±0.090 (5)1.019±0.164 (7)1.134±0.287 (5) a：P<0.01，与普通细菌培养阴性且HpDNA阴性组比较

  3  讨论

    目前研究显示，Hp是上消化道的主要致病菌，并且Hp在国人中具有高感染率。而胆管与胃肠道紧密相邻的解剖关系，使人们有理由推测Hp可能进入胆管系统致病。我们对PIS组和对照组胆汁进行Hp培养，结果均未见Hp菌落，与文献报道相同［1-2］。这可能与Hp生长条件苛刻有关。同时本组采用PCR的方法对PIS组和对照组的胆汁和胆管黏膜行HpDNA检测，结果显示PIS患者胆道中存在Hp感染因素，并且具有较高的检出率，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。说明PIS与Hp感染有关，Hp可能进入胆管系统并具有逃避胆汁碱性环境的自我保护机制，成为PIS的原发性基础致病菌。既往研究表明，细菌繁殖产生的外源性βG在胆红素结石形成中所起作用已得到公认［4］。近年来国内外学者［5-6］更提出内源性βG的质和量与胆红素结石形成也有密切关系。故而我们探究Hp是否像大肠杆菌和厌氧菌一样产生外源性βG，进而导致PIS的形成，同时通过实验了解Hp与内源性βG关系。我们对PIS患者胆汁和肝组织中的内、外源性βG进行检测，研究了Hp和βG关系。由表2和表3可知，在排除了其他普通细菌干扰后，PIS患者有Hp感染者较无Hp感染者的外源性βG无明显差异，然而内源性βG升高，差异有统计学意义(P<0.01)。然而在伴有其他普通细菌感染的PIS患者中HpDNA阳性者与阴性者之间的内、外源性βG比较差异无统计学意义(P>0.05)。其可能由于其他细菌如大肠杆菌等作为一种混杂因素，对内、外源性βG有影响，掩盖了Hp感染与βG之间的关系。以上研究结果显示Hp并没有通过产生大量的外源性βG参与PIS的形成，然而伴有Hp感染者其内源性βG活性升高，是因为Hp具有更强的促进肝组织释放内源性βG的作用。Hp经某种途径进入胆道系统并定植其中，使胆管上皮细胞和肝细胞发生损伤、变性和坏死，内源性βG被大量释放出来，导致胆汁中内源性βG明显升高。释放的内源性βG在病灶处使结合胆红素分解为游离胆红素，与钙等金属离子结合，在胆管内形成小的肝内胆管结石，并成为PIS核心部分。其导致肝内胆管的狭窄，胆汁淤滞，胆流变缓，更易发生细菌感染，促进结石的形成、增大和复发，造成恶性循环，导致PIS的形成。

    总之，我们认为PIS与Hp感染有关，并且Hp可能通过内源性βG途径参与PIS的形成，其具体致病机制有待于更深一步的研究，以便有效的指导临床对于PIS的预防和治疗。

【参考文献】
  ［1］ Neri V, Margiotta M, de Francesco V, et al. DNA sequences and proteic antigens of H. pylori in cholecystic bile and tissue of patients with gallstones. Aliment Pharmacol Ther,2005,22(8):715-720.

［2］ Apostolov E, AlSoud W A, Nilsson I, et al. Helicobacter pylori and other Helicobacter species in gallbladder and liver of patients with chronic cholecystitis detected by immunological and molecular methods. Scand J Gastroenterol,2005,40(1):96-102.

［3］ Wu X Z, Chen D. Helicobacter pylori and hepatocellular carcinoma: correlated or uncorrelated? J Gastroenterol Hepatol,2006,21(2):345-347.

［4］ 黄志强.原发性肝胆管结石症//吴阶平，裘法祖.黄家驷外科学.5版.北京：人民卫生出版社，1994：1393-1395.

［5］ 杨波，朱善德，赵永光，等.肝细胞内源性β葡萄糖醛酸酶与胆红素结石关系的免疫电镜研究.中华肝胆外科杂志，2000，6(2)：123-125.

［6］ Ho K J, Hsu S C, Chen J S, et al. Human biliary betaglucuronidase: correlation of its activity with deconjugation of bilirubin in the bile. Eur J Clin Invest,1986,16(5):361-367.