基质金属蛋白酶-2在肝硬化患者肝组织中的表达

作者：张平，李国富，刘娅，任芳    作者单位：宁夏医学院附属医院感染性疾病科，银川 750004

【摘要】  　　目的 了解基质金属蛋白酶-2(MMP-2)在肝组织中的表达情况及与肝硬化患者肝功能损害程度的关系。方法 采用免疫组织化学方法(SP法)观察了7例正常肝组织和23例肝炎后肝硬化患者肝组织中MMP-2表达的情况。结果 在肝硬化患者肝组织中发现MMP-2主要在肝细胞、血管内皮细胞、肝窦内皮细胞及胆管内皮细胞的胞浆中高表达，表达情况与肝硬化Child-Pugh A、B、C分级相关，随着Child-Pugh分级及纤维化程度增高，MMP-2表达逐渐减少，A、B级患者肝组织中MMP-2表达最多，与对照组比较明显增高(P＜0.01)，A、B级与C级之间比较均有统计学意义(P＜0.05)。结论 肝硬化Child-Pugh分级不同，MMP-2表达发生了不同的变化，提示MMP-2在肝硬化形成中有重要作用。

【关键词】  基质金属蛋白酶 肝炎后肝硬化 免疫组织化学

　　The Clinical and Immunohistological Study on the Effects of MMP-2 on Liver Fibrosis

　　(Dept. of Infectious Diseases，the Affiliated Hospital，Ningxia Med. Coll.，Yinchuan 750004)
　　Abstact：Objective  To detect the expression of MMP-2 in hepatic tissue and to explore the relation between serverity of hepatic injury and the pathogenesis of fiberosis. Methods  The expresion of MMP-2 were detected by immunohistochemistry and result was analyzed by picture quantitative analysis technique using immunohistological examination(SP method). The expression of MMP-2 were observed in the liver tissue in 7 normal subjects and 23 liver cirrhosis cases with a history of hepatitis. Results  Immnoreactive MMP-2 was mainly expressed in the cytoplasm of hepatocyte，the blood vessel endothelium，hepatic sinusoids and biliary endothelial cells..Expression level in patients was correlated with the Child-Pugh classification. As the Child-Pugh grading increased，the MMP-2 expression level decreased. The expression in Child-Pugh class A and B were significantly higher than that in class C(P＜0.01). Conclusion  The results suggests that MMP-2 plays an important role in in the formation of hepatic fibrosis. Different Child-Pugh class show different expression level in the hepatic fibrosis.

　　Key words：matrix metalloprotease；cirrhosis after hepatitis；immunohistochemistry  

　　肝硬化发病机制复杂，研究表明［1］肝硬化形成的环节关键是肝细胞损伤后的纤维化过程，许多因素参与纤维化过程，其中细胞因子和细胞基质降解倍受重视。基质金属蛋白酶参与降解细胞外基质成分。国内研究较多的是基质金属蛋白酶-1(MMP-1)，基质金属蛋白酶-2(MMP-2)(又称明胶酶A或Ⅳ型胶原酶)亦见报道，有关基质金属蛋白酶与肝纤维化的形成关系，多限于动物实验观察［2］，而肝硬化患者临床观察报道较少。本文采用免疫组织化学方法(SP法)观察基质金属蛋白酶-2在肝硬化病程中的表达情况，探讨其与肝硬化发病之间的关系。

　　1  材料与方法

　　1.1  研究对象

　　1.1.1  肝硬化组

　　23例肝硬化肝组织标本均为我院临床和病理资料完整的肝炎后肝硬化患者手术后或肝活检后的病理组织切块(其中包括我院4例肝硬化成功的行肝脏移植手术术时切下的患者肝组织标本)。病理诊断结节性肝硬化16例，早期肝硬化3例，门脉性肝硬化4例。Child-Pugh分级A＋B级15例，C级8例。

　1.1.2  对照组

　　7例为肝血管瘤患者手术后的正常肝组织标本。

　　1.2  试剂

　　1.2.1  基质金属蛋白酶-2免疫组化试剂组成

　　第一抗，基质金属蛋白酶-2单克隆抗体(Monoclonal Antibody Anti-Human MMP-2)，试剂编号 MAB-024(FOR RESEARCH USE)，浓缩型0.1mL。预实验选择最佳工作浓度1∶50。SP超敏试剂盒，DAB显色液、PBS修复液、防脱胶、复染剂。

　　1.3  肝组织中MMP-2表达的免疫组化检测

　　切片脱腊，水化，直接加过氧化酶阻断溶液(试剂A)，除去PBS液，加MMP-2浓缩型试剂；切片加生物素标记的第二抗体，除去PBS液；切片加链霉菌抗生物素—过氧化物酶溶液及配置的DAB溶液，苏木素复染；以肝脏细胞胞浆内有棕黄色颗粒为阳性。

　　l.4 结果判断

　　每张切片选取四周及中央五个区域，选取该区域阳性反应最多的视野。阳性细胞数25%～50%为(+)，51%～75%为(++)，＞76%为(+++)。无阳性信号或阳性细胞数11%～24%为(-)。

　　1.5  统计学方法

　　组间的两两比较采用StudentNewmanKeuls检验。

　　2  结果

　　2.1  肝硬化患者肝组织中MMP-2免疫组化染色结果

　　22例肝硬化肝组织中均可见有棕黄色颗粒。阳性反应颗粒细小、密集成团。MMP-2表达主要位于肝细胞胞浆、血管内皮细胞及肝窦细胞的胞浆、胆管的内皮细胞(图1，见封4)。

　　2．2  MMP-2表达情况与肝硬化Child-Pugh分级的关系(表1)表1  肝组织中MMP-2表达情况与Child-Pugh分级之间的关系（略）

　　随着Child-Pugh分级增高，MMP-2表达逐渐减弱，A＋B级与对照组(χ2=13.62，P＜0.01)，A＋B级与C级之间比较差异均有统计学意义(χ2=8.13，P＜0.05)。

　　3  讨论

　　肝硬化是肝纤维增生连续发展的病理过程。该过程反应出细胞外基质(ECM)代谢的消长。目前研究表明，肝硬化的发生除因基质合成增多外，也是基质降解改变的结果。基质金属蛋白酶-2是参与降解细胞外基质成分的基质金属蛋白酶(MMP)家族的重要成员，属于Ⅳ型胶原酶，又名明胶酶A(72KD)，研究表明肝硬化患者的肝组织中基质金属蛋白酶-2的基因表达增加，促进肝纤维化进程。本研究发现，22例肝硬化肝组织中均可见有棕黄色颗粒。阳性反应颗粒细小、密集成团。MMP-2表达主要位于肝细胞胞浆、血管内皮细胞、胆管内皮细胞及肝窦细胞的胞桨中高表达。

　　Lichtinghagen K发现，MMP-2以一种独特的机制激活［3-4］。有报道MMP-2活化后能降解变性胶原和纤维连接蛋白，可裂解Ⅰ型胶原、促进肝星状细胞(HSC)增殖［5］。MMP-2主要在细胞间隙起降解ECM的作用，在组织中主要受金属蛋白酶组织抑制因子-2的调节。Takahara 等用Northern杂交法检测人纤维化肝脏中MMP-2比正常对照组高1.4倍［6］。免疫电镜检测MMP-2表达主要集中于肝星状细胞及纤维化区域的成纤维细胞，说明其来源于以上细胞。 在胆管结扎引起的大鼠纤维化模型中MMP-2活性升高。本实验提示肝硬化患者肝组织中MMP-2表达增强，表达情况与肝硬化Child-PughA、B、C分级相关。随着Child-Pugh分级及纤维化程度增高，MMP-2表达逐渐减少，A、B级患者肝组织中MMP-2表达最多，高于对照组和C级。MMP-2表达与肝功能分级密切相关，随着肝功能分级越高，肝损害、纤维化程度越重，MMP-2表达水平越低。Lichtinghagen［7］等研究发现肝硬化进展期MMP-2表达下降了约60％～70%，主要是由于MMP-2以酶原形式分泌到细胞外，MMP-2裂解激活后才有降解ECM的活性。MMP-2的活化发生在细胞紧邻的环境中，因此凡是与 HSC活化有关的因素几乎均与MMP-2表达活化有关［8］。正常人肝星状细胞为肝细胞的1/20，肝纤维化时肝星状细胞增生、数量增加，表型转化为肌成纤维细胞，具有合成纤维性胶原的高度活性。肝星状细胞稳态的维持依赖于Disse间隙中Ⅳ型胶原，正常肝时，肝星状细胞处于静止期，可产生少量的Ⅲ、Ⅳ型胶原和细胞因子(TGF-、FGF、VEGF、ET-1)以及MMP，Ⅳ型胶原是构成基底膜主要成分，亦是MMP-2的主要作用底物。肝损伤时由于细胞-基质间相互作用，激活肝星状细胞、枯否细胞表达和分泌MMP-2，MMP-2可破坏正常内皮下基底膜胶原及Disse间隙周围的基底膜，致使HSC周围的窦周基底膜成分发生改变，改变了肝脏中ECM的微环境，参与肝纤维化进程［9］。由于病毒感染、炎症等致慢性肝损伤持续进行，故纤维化进行性发展，致MMP-2表达较强，随着星状细胞激活和纤维化发展，HSC过多的合成并分泌多种间质胶原和其它基质成分，随着基质转换，MMP-2的特异性组织抑制剂(TIMP-2)表达增强，同时MMP-2的降解作用减弱，致使ECM在肝组织内大量沉积［10］。胶原沉积于Disse间隙，导致肝窦毛细血管化和肝细胞周围纤维化，破坏肝小叶，引起肝内外循环障碍，进而降解基底膜；肝窦结构破坏，肝细胞再生失去正常的网状支架，肝小叶结构无法恢复正常。至肝硬化中后期，肝细胞数量减少，纤维结缔组织增生至HSC数目亦逐渐减少，MMP-2表达减少。故认为MMP-2是肝脏特异蛋白［11］。有关肝硬化的形成机制，仍有待于进一步研究。

【参考文献】
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　　［3］施均平，邬菊英，潘红英. 酒精性脂肪肝患者ET-1、TNF-a水平变化临床意义［J］. 浙江中医学院学报，2002，6(26)：26-27.

　　［4］中华医学会传染病与寄生虫病学会、肝病学分会、病毒性肝炎防治方案［J］. 中华肝脏病杂志，2000，8：324-329.

　　［5］Aimes RJ，Quigley JP. Matrix metalloproteinase-2 is an interstitial collagenase-inhibitor-free enzyme catalyzes the cleavage of collagen fibris and soluble native type 1 collagen generating the specific 3/4-and 1/4-Length fragments［J］. J Bio Chem，1995，270：5872-5875.

　　［6］Takahara T，Furuid K，Yata Y，et al. Dual expression of matrix metalloproteinase-2 and membrane-type-1 matrix metallopro-teinase in fibrotic human livers［J］. Hepatology，1997，26：1521.

　　［7］刘诗权. 基质金属蛋白酶及其组织抑制因子和肝纤维化［J］. 胃肠病学，2002，7(3)：183-185.

　　［8］Yang C. Fibrosis：insights into migration of hepatic stellate cells in response to extracellular matrix and growth factors［J］. Gastroenterology，2003，124(1)：147-157.

　　［9］Fabio Quondamatteo，Thomas Knittel，et al. Matrix metalloproteinases in early human liver development［J］. Histochem Cell Boil，1999，112：277-282.

　　［10］Shinozaki-Y，Akutsu-shigeno. Inhibition of matrix metalloproteinase-2 activity by siderophores of Pseudomonas species［J］. Applied Microbial and Cell Physiology，2004，64：840-847.

　　［11］Murawaki Y，Yamada S，Ikuta Y，et al. Clinical usefulness of serum matrix metallproteinases-2concenteition in patients with chnonic vital liver dissease［J］. Hepatol，1999，30(6)：1090-1098.