肝细胞癌的基因治疗研究进展

作者：傅晓辉 
作者单位：第二军医大学东方肝胆外科医院，上海 200438
 
【摘要】  本文对肝细胞癌的基因治疗的两个要点即基因转移系统和基因治疗策略的研究进展进行综述，重点介绍了肝细胞癌的溶瘤病毒、诱导细胞凋亡、基因前药系统、干扰RNA技术以及基因免疫治疗等策略。

【关键词】  癌 肝细胞 基因 载体 综述文献

    基因治疗就是将基因导入细胞，达到治疗疾病的目的。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的基因治疗在经历了初期的热潮后一度步入低谷，近年来，随着对HCC生物学行为认识的深入以及分子生物学技术的进展，HCC的基因治疗再次成为研究的热点。任何基因治疗都包括两个关键环节，一是使用何种基因转移系统（载体），二是采用何种基因治疗策略[1]。

    1  基因载体系统的研究

    现在常用的载体系统可以分为两大类，一是病毒类载体，二是非病毒类载体。后者包括裸露DNA、脂质体及纳米颗粒等等。这类载体的优点是，一般易于大量生产，毒性和免疫原性低，但转导效率较低，且无法实现基因的长期稳定表达，未来可能发展出解决这些问题的新的非病毒性载体系统。病毒性载体包括RNA病毒和DNA病毒，又包括整合和非整合性载体，前者可以使基因终身表达，非整合性载体可以以游离基因的形式在非分裂期细胞中获得表达。目前在肝癌基因治疗研究中应用最为广泛的是逆转录病毒载体系统和腺病毒载体[2]。

    1.1  逆转录病毒载体系统  由于逆转录病毒是最早应用于基因转移的载体系统，它们已在多方面获得了广泛的应用。由于它们具备整合和长期基因表达的特性，使其在构建表达某种基因的稳定细胞系和细胞谱系的标志中具有重要的价值。它们具有的对细胞分裂的依赖性，使其体内的应用局限于活跃分裂的组织，如干细胞和肿瘤细胞。而慢病毒载体则可通过直接注射的方式应用于多种组织和器官如脑组织、眼、肝脏和肌肉。它们也被用于骨髓移植前的造血细胞的体外转导。

    野生型病毒的被膜有限的细胞趋向性是逆转录病毒转导应用的一个主要障碍。然而，逆转录病毒具有从相关及不相关病毒中获得env糖蛋白的能力，从而使其具有假型化的能力。多种病毒被膜蛋白被用于逆转录病毒的假型化，包括VSV-G糖蛋白或者双向性MLV被膜蛋白。假型化还可以传递某种特异性的病毒趋向性。例如使用Mokola狂犬病毒的G蛋白假型化，可以使载体获得神经细胞趋向性和逆轴突传输能力，纤丝病毒（Ebola Zaire）被膜可以转导进入呼吸道上皮。有趣的是，逆转录病毒的输注途径对转导效率的影响微乎其微。

    整合前的复合体的逆转录和向核内的转运是受限制的过程，特别是处于终点分化的有丝分裂后细胞。所有逆转录病毒的病毒前DNA的合成都和细胞的状态密切相关，在静止期的细胞中缺乏腺苷及各种细胞辅助因子，这可能是这些细胞中逆转录作用不完全的原因。与其他逆转录病毒不同的是，FV载体颗粒由于在病毒合成之前就存在逆转录过程的激活，因此其可包含全长逆转录病毒DNA，这提示着FV载体在某些有丝分裂后细胞中可以实现较高的基因转移效率。

    由于HIV-1是一种人类病原体，基于HIV-1的慢病毒载体系统就存在一个生物安全性的问题。现有的此类载体都是去除了所有的辅助蛋白，病毒的基因物质在载体中已被降低到最低限。因此，这些载体复制能力极低，发生同源重组的可能性也被降到了最低。此外，包装结构的密码子最优化的处理进一步降低了发生同源重组的可能。使用基于其他慢病毒的载体系统可能去除这样的担忧。然而，将非人源性的慢病毒导入人体组织的危险性尚无确切的评价[3-5]。

    1.2  腺病毒载体系统  第一代腺病毒载体是将腺病毒基因组中的E1置换为转基因。尽管E1缺陷的病毒缺乏复制能力，但在一些细胞系中，还是可以产生一些病毒蛋白，从而引发机体的细胞免疫反应。因此，为了降低载体的免疫原性，研究者们设计了第二代的腺病毒载体，将其余的病毒转录单位如E2，E4基因组也去除掉。由于E2区编码的蛋白质对病毒染色体的复制是必须的，因此必须在包装细胞中提供此基因。因此大多数的研究致力于去除E4区域的基因，后者编码的蛋白质的作用是提高病毒DNA复制的效率以及后期蛋白质的合成。E4区域基因的部分缺失可以制成有活力的载体，研究者们还设计了E4补足的细胞系，可以更大限度地去除E4基因。尽管E4区域的缺失可以提高腺病毒的克隆能力，但也有报道说E4区域可以起到维持基因长期表达的作用。理论上我们可以将病毒基因去除到极限，即仅保留反向末端重复序列（ITRs）和顺式作用包装信号，将其他所有的病毒基因序列去除。这些载体的繁殖依赖于辅助病毒，这就产生了病毒纯化的问题。第三代腺病毒载体的一个关键策略就是发展一种高通量，依赖辅助病毒的载体，此载体建立在Cre/loxP系统上，可以位点特异性地去除DNA。使用此系统可以在稳定表达Cre重组酶的293细胞中，特异性去除包含loxP位点的腺病毒载体中的25kb的腺病毒基因。也可以将腺病毒辅助病毒中的包装信号去除。这样的载体具有良好的基因运输能力，并可获得长期稳定的基因表达，尽管生产过程繁复，也不能完全避免不良的免疫反应[6-7]。

    2  HCC的基因治疗策略

    2.1  溶瘤病毒  溶瘤病毒的作用机制可能包括以下数种。?譹?訛通过病毒的复制直接溶解破坏细胞，再进入邻近的细胞，复制、溶解细胞。?譺?訛病毒复制过程中产生的蛋白质对细胞的毒性作用。?譻?訛溶瘤病毒感染可以诱发非特异性及特异性的抗瘤免疫反应，导致肿瘤的破坏。?譼?訛溶瘤病毒可以引起肿瘤细胞对化疗和放疗敏感。?譽?訛将抗癌基因插入溶瘤病毒，扩大抗瘤效应[8-10]。

    视网膜母细胞瘤肿瘤抑制蛋白通路在多种人类肿瘤中呈下调表现，而E2F启动子活性选择性的增强，端粒末端转移酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase，TERT)活性也增强，这些都是肿瘤细胞有别于正常细胞的表现。因此可以利用E2F－1启动子和TERT启动子来驱动E1A基因的表达，从而将腺病毒的复制局限于缺乏Rb通路的肿瘤细胞（如Hep3B细胞）或者TERT阳性的肿瘤细胞。这两个实验中都观察到了对荷瘤动物肿瘤的强大的抗瘤效应[11-12]。

    泡状口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)是一种非致病性RNA病毒，在正常细胞中它对免疫反应性纤维结合素（immunoreactive fibronectin，IFN）介导的抗病毒效应非常敏感，而在癌细胞中却可以正常地繁殖。一种解释是在许多肿瘤中（包括HCC）都缺少IFN介导的抗病毒通路。因此，它已被用于结直肠多发肝转移和HCC的治疗。研究显示，VSV可以引起肝脏肿瘤的广泛坏死，但对正常肝细胞没有损害，在动物实验中证实，可以显著延长动物的生存时间。

    在临床对照研究中，ONYX-015腺病毒可以安全地应用于原发性或转移性肝癌，不论是瘤内注射或者静脉使用。对结直肠癌肝转移的患者肝动脉内注射病毒再使用5-FU化疗的安全性也已得到证实[13-14]。

    2.2  诱导细胞凋亡　　HCC中p53的作用一直存在争议，因为事实上约80％的HCC并不存在p53基因的变异。然而，将野生型p53基因导入细胞一直被尝试用于HCC的治疗，而不论其p53基因的状态。在体内外实验中已经证实了野生型的p53基因的过度表达可以诱发HCC细胞的凋亡，或者抑制肿瘤的生长。p53基因只有转入每一个肿瘤细胞才能发挥其诱导凋亡的作用，而肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）蛋白却可以以膜蛋白或者可溶性分子的方式诱导细胞凋亡。更重要的是，TRAIL可以在体内选择性地作用于肿瘤细胞。研究发现，用电穿孔技术将TRAIL载体注入肿瘤细胞，不但可以抑制注入处的肿瘤的生长，还可以抑制远处皮下种植的肿瘤的生长，而肝脏损害轻微、短暂。更加引入关注的是，Ma等人的研究设计构建了腺病毒相关病毒(AAV)载体携带TRAIL细胞外区域，并融合有一个信号肽，可以口服或者腹腔内注射，可以获得长期的高水平的可溶性TRAIL的表达，显著抑制皮下种植HCC的生长，对正常肝细胞无损害。这引发人们思考使用此全身用药系统对原位生长的HCC有无作用。需要注意的是表达TRAIL受体的肿瘤细胞并不总对TRAIL介导的凋亡敏感。是否对TRAIL敏感不仅取决于有无TRAIL受体，还取决于有无其他细胞内介质。然而将TRAIL和化疗药物结合可以提高抗瘤效应[15]。

    既往的研究已经显示IL-24作为一种新型肿瘤抑制基因对肿瘤细胞在体外和体内都具有抑瘤效应。最近研究者们构建了携带IL-24的腺病毒载体[16]，发现对SMMC-7721细胞具有显著的凋亡诱导作用，瘤内注射此重组载体可以抑制肿瘤的生长，并提示其机制可能与VEGF的下调和非p53依赖凋亡相关蛋白酶的上调有关。

    2.3  基因前药活化系统  传统化疗对肿瘤细胞和正常细胞都有杀伤作用。为了有效地控制肿瘤生长，就需要使用较大剂量的化疗药物，也因此加重了化疗的副作用。分子化疗的原理就是将某些基因选择性转入肿瘤细胞，使后者对注入体内的化疗药前体敏感，而这些化疗药前体对正常细胞无害。目前最为常用的分子化疗系统就是单纯疱疹病毒胸苷激酶系统（HSV-tk）和更昔洛韦（GCV）合用。其工作原理是HSV-tk可以将GCV单磷酸化，之后在细胞激酶的作用下，GCV被进一步磷酸化成为三磷酸盐，后者整合进入细胞DNA，进而抑制DNA的合成，最终导致细胞的死亡。这一系统还有一个更吸引人的地方，就是不仅转化细胞发生死亡，周围的细胞也可以被杀死，即存在所谓的旁观者效应，其原因可能是有毒的代谢产物弥散所致，也有可能是死亡细胞引发机体免疫反应所致[17]。

    大量的实验研究证实此系统对实验性HCC有效。逆转录病毒仅转染分裂期细胞，在皮下种植肿瘤中HSV-tk系统得到特异性的表达，注入GCV后，可以观察到肿瘤的消退。但为了获得有效的治疗，必须反复注射病毒载体系统。治愈的动物可以获得对野生型HCC的免疫，这可能是诱发了旁观者抗瘤效应的缘故。有研究将腺病毒HSV-tk系统通过门静脉系统注入化学诱导的肝癌及结直肠癌肝转移的动物模型体内，这些研究证实了这一系统的有效性，但同时也发现了注入GCV可导致实验动物产生严重的肝脏功能损害和高死亡率。这提示我们，虽然理论上，细胞毒代谢产物主要进入发生细胞分裂的肿瘤细胞，事实上，正常组织细胞也受到了此系统的影响。以后的研究证实，磷酸化的GCV既可以整合入细胞核DNA也可以整合入线粒体DNA，从而影响正常组织细胞线粒体的功能。为了避免这一副作用，可以采用瘤内注射或者肿瘤特异性的启动子。近年来的一项临床研究已经证实，瘤内注射腺病毒编码HSV-tk系统同时合并全身应用GCV在结直肠癌肝转移中应用的安全性[18]。

    还有一些研究探索了其他的自杀基因/前药系统。大肠杆菌（E.coli）胞嘧啶脱氨酶可以将5-氟胞嘧啶转化为有毒性的5-FU。据称此系统比HSV-tk/GCV系统的肝毒性低，旁观者效应要强。对皮下接种的HCC实验动物进行瘤内注射Ad-CD，或者将此病毒静脉注入结直肠癌肝转移动物模型，然后全身应用5-FC，可以观察到肿瘤明显缩小。大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）可以将嘌呤类似物如氟达拉滨转化为强毒性的代谢产物，可以抑制RNA、蛋白质和DNA的合成。这些毒性代谢物可以通过脂质膜，对周围的细胞发生杀伤作用，因此，PNP/氟达拉滨组合也有所谓的旁观者效应。由于其代谢物可以自由在细胞间弥散，因此对分裂期和非分裂期的细胞都有毒性作用，这也对其临床应用的安全性问题提出了挑战[19]。

    2.4  基于干扰RNA技术的基因治疗 　Gankyrin是一种新鉴定的癌基因，在HCC中其表达率高达97％。对其进行序列分析发现，它是p28的基因产物，是人类26S蛋白体的调节复合物的亚单位。p28GANK的过度表达可以增加pRB的磷酸化，抑制p16INK4a的活性，促进细胞的增殖。可以利用RNA干扰技术来抑制HCC中p28GANK的表达。研究结果证实，在裸鼠实验中，将p28GANK基因封闭，可以降低pRB的磷酸化，增强半胱天冬酶8和9介导的凋亡，抑制肿瘤的生长。干扰RNA技术还用来下调某些基因，使肿瘤细胞对化疗及TRAIL或者CD95介导的凋亡反应变得敏感，如有一项研究使用干扰RNA技术，封闭Mcl-1基因的表达（Bcl-2家族的成员），可导致Hep3B细胞内的半胱天冬酶3的活性升高，使肿瘤细胞对化疗和TRAIL介导的凋亡反应的敏感性增加。还有研究发现，干扰RNA技术封闭C-JunN端激酶（JNK）的表达（和细胞生存信号传导通路相关），可以显著增强HepG2细胞中CD95介导的凋亡反应，但对Huh-7和Hep3B细胞无此作用[20-21]。

    干扰RNA技术可以用来封闭和肿瘤转移相关的基因的表达。丝氨酸蛋白酶尿激酶型纤溶酶原活化剂（u-PA），在癌症的侵袭过程中发挥着重要的作用，其在HCC中也呈上调表达。使用干扰RNA技术下调SKHep1C3细胞中u-PA的表达可以降低细胞的迁移、侵犯和增殖能力。糖酵解和质子的分泌增加和肿瘤细胞的增殖及肿瘤细胞的侵袭性相关。质子泵V-ATPase可以将质子泵出细胞，因此其在维持肿瘤细胞细胞质的中性环境和胞外酸性环境发挥着重要的作用。一些具有高转移潜能的肿瘤细胞的细胞膜表面都表达有此酶。有研究通过干扰RNA技术下调此酶的亚单位ATP6L的表达，从而抑制此酶的活性，可以有效地抑制肿瘤的生长和转移。虽然干扰RNA技术在体外实验中显示出其优越的封闭基因表达的作用，但由于目前还缺乏有效的转移系统，使其无法进入大多数肿瘤细胞，这类似于基于p53的基因治疗所面临的问题[22-23]。

   2.5  基因免疫治疗  由于免疫耐受和免疫缺失，机体常常对自体抗原难以产生免疫反应。因此，表达AFP的质粒DNA疫苗仅能引发较弱的抗瘤免疫反应，但合用表达细胞因子（如IL-12，GM-CSF，IL-18）的DNA疫苗则可以加强抗瘤免疫反应。对实验动物先使用编码AFP和鼠GM-CSF的DNA疫苗进行初次免疫，然后再使用表达AFP的非复制性腺病毒载体进行加强免疫，可以获得更加强的免疫反应。未来还可以尝试使用一些免疫增强剂来与AFP合用，进一步增强抗瘤免疫反应，如使用热休克蛋白、HSV-VP2壳皮蛋白、钙网织蛋白等[24]。

    此外，肿瘤微环境中的细胞因子也可以影响免疫细胞的活化和成熟。全身大剂量的运用细胞因子的效果差于使用基因治疗方法增加局部的细胞因子的疗效，且有较大的副作用。HCC的治疗中，有些细胞因子的疗效得到了证实。瘤内注射或者经肝动脉注射编码IL-12的腺病毒可以使原位肝癌鼠模型的肿瘤明显消退。这一过程中，NK细胞的激活和抗血管生成是其作用的机制。将IL-12和共刺激分子如B7.1并用可以增强抗瘤作用。将表达这两种物质的腺病毒瘤内注射入皮下接种的HCC动物模型或者自发性肝癌土拨鼠模型取得了强烈的抗瘤反应。研究者比较了编码GM-CSF的腺病毒和同时编码GM-CSF和内皮他丁瘤内注射原位肝癌鼠模型，结合型基因治疗组的抗瘤效应明显强于前者，而且内皮他丁可以增强CTL的作用。IL-12和GM-CSF基因治疗都分别和HSV-tk/GCV治疗结合以增强抗瘤作用。这些结果都提示免疫治疗和其他基因治疗策略相结合将可能产生更佳疗效[25-26]。

    3  结论

    应用基因治疗方法治疗HCC的研究已经开展了十多年，研究者们设计了大量的治疗策略和载体系统以寻求更佳的治疗效果。然而，动物实验中观察到的基因治疗对实体瘤的良好作用，在临床治疗中尚无法达到。如此鲜明的对比促使我们思考，到底是什么限制了基因治疗在临床患者中的作用？动物模型的局限性，转基因不能持续表达以及肿瘤细胞具有的多样性和可变性都可能是其中的原因。总之，基因治疗具有极强的可塑性，无论是其备选治疗基因、载体和使用的途径和次序的多样性，还是在各种治疗策略的选择和组合。基因治疗必将成为肝癌治疗的利器之一[1]。

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