肝靶向药物GalHSA5FU对Bel7402肝癌细胞增殖和细胞周期的影响

作者：李育超,周克元,蔡春

作者单位：广东医学院生物化学与分子生物学研究所; 临床生物化学教研室;分析中心，广东湛江524023

        【摘要】  　　目的 了解合成的肝靶向药物半乳糖化人血清白蛋白与5氟尿嘧啶偶联物(galactosylated human serum albumin 5fluorouracil conjugate，GalHSA5FU)对肝癌细胞Bel7402细胞增殖和细胞周期的影响。方法 采用MTT法（噻唑蓝还原法）检测GalHSA5FU对细胞生长的抑制率和IC50，流式细胞术分析细胞周期变化，荧光染色法观察细胞凋亡。结果 0.953～30.500mg·L－1 GalHSA5FU分别处理Bel7402细胞24、48、72h，细胞增殖被抑制，其增殖抑制率随药物质量浓度的增加和作用时间的延长而增高，其IC50值分别为（20.957±0.752）、（11.793±0.546）、（5.843±0.735）mg·L-1，48、72h的IC50值明显低于24h的IC50值，差异均有统计学意义 (P<0.01)。相同质量浓度5FU与GalHSA5FU作用24h，其IC50值差异无统计学意义 (P>0.05)。GalHSA5FU作用Bel7402 24h，S期细胞明显升高，G2/M期细胞明显下降。荧光染色偶见凋亡细胞。结论 GalHSA5FU能抑制Bel7402细胞增殖，且抑制作用具有剂量和时间依赖性；一定剂量的GalHSA5FU可能通过阻滞Bel7402于S期而抑制其增殖。

【关键词】  GalHSA5FU；肝癌细胞；增殖；细胞周期

　　Effect of hepatic targeting drug GalHSA5FU on proliferation and cell cycle of　human hepatocarcinoma cells (Bel7402)
   
　　LI Yuchao, ZHOU Keyuan, CAI Chun,ZHANG Haitao
   
　　(Institute of Biochemistry and Molecular Biology;Department of Clinical Biochemistry;Analysis Center, Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023)
  
　　Abstract:  Objective   To investigate the effect of Galactosylated human serum albumin 5fluorouracil conjugate (GalHSA5FU) on proliferation and cell cycle in human hepatocarcinoma cells (Bel7402). Methods  The inhibitory rates of cell proliferation and IC50 values of GalHSA5FU were determined by MTT assay. Cell cycle of the tumor cells was analyzed with flow cytometry. Results  Cell proliferation was inhibited after the cells were treated with various concentrations of GalHSA5FU (ranging from 0.953～30.500mg·L-1) for 24, 48, and 72h, respectively. The inhibitory rates of cell proliferation were enhancing with the increase of drug concentration and treatment time (P<0.01). The IC50 values of GalHSA5FU were (20.957±0.752), (11.793±0.546), and (5.843±0.735) mg·L-1 at 24, 48 and 72h, respectively. The IC50 values at 48h and 72h were significantly lower than that at 24h (P< 0.01). After the treatment of 24h, the proportion of Bel7402 cells in the S phase increased, while the proportion in the G2/M phase decreased. There was little number of apoptotic cells according to the fluorescence staining assay. Conclusion  GalHSA5FU can inhibit the proliferation of Bel7402 cells in a dose and timedependent manner, and can arrest Bel7402 cells in S phase.
   
　　Key words: GalHSA5FU; hepatocarcinoma cells; proliferation; cell cycle

肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范围内发病率较高的恶性肿瘤［1］,其治疗的首选方法是手术［23］。然而，除了疾病晚期或肝功能不全患者，只有9％～37％的患者能接受外科手术［45］，对于大多数肝癌，化疗仍是最常用的治疗方法。而目前化疗存在的主要问题除了治疗药物本身的药理作用不够理想之外，其次是药物没能有效的运输至肝脏的病变部位，即药物的肝靶向性差。要提高药物在肝脏的浓度，就需要提高血药浓度，但这样也会加重药物的副作用。迄今为止氟尿嘧啶类抗代谢抗癌药及其衍生物仍是治疗肝癌的一线药物［6］。由于5FU是一种细胞毒类抗肿瘤药物，对于全身其它组织尤其是快速分裂的组织，如胃肠黏膜和骨髓等毒副作用大，因此寻找疗效好、副作用小的抗肝癌药物，并提高药物的肝靶向性是现在抗肝癌药物研究的主要方向之一。
   
　　通过羟甲基琥珀酰将5FU共价连接到半乳糖化的人血清白蛋白（GalHSA）上，合成GalHSA5FU偶合物，具有将5FU主动导向肝脏并由肝细胞膜的肝结合蛋白转运到细胞内进行代谢的特点［7］，以期能提高5FU对肝脏肿瘤的治疗作用，减少全身其它组织器官的毒副作用。然而5FU与半乳糖基人血清白蛋白偶联后，其分子结构发生了改变，尚不明确此改变对其抗肿瘤活性是否发生影响。本文将对GalHSA5FU抗肝癌效果进行初步评价，现将结果报道如下。
   
　　1  材料与方法
   
　　1.1  材料

　　1.1.1  细胞株  本室保存的人肝癌细胞株Bel7402。

　　1.1.2  药品试剂  GalHSA5FU (M=82150D )，由本校分析中心合成，其结构式如图1所示。
  
　　图1  GalHSA5FU的结构式（略）
   
　　5FU由上海旭冬海普有限公司生产；DMEM培养基购自美国Gibco公司；新生小牛血清购自杭州四季青生物材料公司；胰蛋白酶、MTT、N,N二甲基甲酰胺(DMF)均是美国Amresco公司产品；Hoechst33258是美国Simga公司产品；其余试剂为国产分析纯。
                           
　　1.2  方法

　　1.2.1  细胞培养  Bel7402细胞在体积分数为5%CO2、37℃条件下，用含10%（体积分数）小牛血清，青霉素(100u·mL-1)，链霉素(100mg·L-1)的DMEM完全培养基传代培养，实验用细胞均处于对数生长期。

　　1.2.2  药物配制  30.5mg 5FU用生理盐水稀释至10mL，得质量浓度为3.050g·L-1的贮备液，分装冻存，临用前用培养基稀释成各所需质量浓度。128.5　mg GalHSA5FU(编号041021，M=82150Da，每摩尔GalHSA5FU含5FU 15摩尔)溶于10　mL生理盐水中，得质量浓度为12.85g·L-1的贮备液（该质量浓度折算含5FU为0.305g·L-1，以下GalHSA5FU质量浓度均为折算成5FU的药物质量浓度），临用前用培养基稀释成各所需质量浓度。

　　1.2.3  细胞生长增殖抑制试验  采用MTT法：取对数生长期的细胞，按1×104/孔于100μL培养液中接种于96孔板，在37℃、5%（体积分数）CO2条件下过夜后，加入不同质量浓度的GalHSA5FU，使其终质量浓度分别为0.953、1.906、3.812、7.625、15.250、30.500mg·L-1，对照组加入相应体积的生理盐水，每组设4个平行孔。用药后再分别培养24、48、72h，每孔加入10μL MTT（5.0g·L-1），继续培养4h。吸出上清液，每孔加入100μL 20%SDS50%DMF，微量振荡器震荡5min，37℃孵育4h，于ELx800型酶标免疫测定仪（美国BioTek公司）以测定波长570nm、参考波长630nm测定吸光度。据公式：细胞生长抑制率(%)=(1-处理组的吸光度/对照组吸光度)×100%计算出抑制率，绘制质量浓度抑制率曲线，按改良Karber公式计算IC50值［8］。

　1.2.4  流式细胞术检测细胞周期  不同质量浓度GalHSA5FU作用Bel7402细胞24h后，收集细胞，PBS洗涤两次，加入体积分数为0.7的冰乙醇，4℃固定24h以上。PBS洗涤离心，加1mL 50mg·L-1 PI（含10mg·L-1 RNaseA）于室温避光处染色30min，400目筛网过滤，用Coulter Epics-XL型流式细胞仪进行检测。

　　1.2.5  Hoechst33258荧光染色  不同质量浓度GalHSA5FU作用Bel7402细胞24h后，收集细胞，PBS洗涤一次，加荧光染料Hoechst33258至终质量浓度为10mg·L-1，37℃避光染色10min，取10μL细胞悬液滴于载波片上，盖上盖波片，紫外光激发，荧光显微镜下随机计数200个细胞，观察细胞核形态及颜色改变以区分出天然细胞以及凋亡细胞，并计算出凋亡率。
   
　　1.3  统计学处理
   
　　以SPSS 11.0 for windows 统计软件包进行数据处理，采用SNKq检验。
   
　　2  结果
   
　　2.1  细胞增殖抑制实验结果
   
　　0.953～30.500mg·L-1 GalHSA5FU 分别处理Bel7402细胞24、48、72h，细胞增殖被抑制，其抑制率均随质量浓度(剂量)的增加和时间的延长而增高，表现出剂量和时间依赖性，详见表1。48、72h的IC50值明显低于24h的IC50值，差异均有统计学意义(P<0.01)，而5FU处理Bel7402细胞24h的IC50值与GalHSA5FU处理24h的IC50值相比差异无统计学意义（P>0.05），详见表2。
   
　　表1  不同剂量GalHSA5FU对Bel7402细胞增殖的影响 （略）

　　各项两两比较，P<0.01。
   
　　表2  GalHSA5FU作用不同时间的IC50值（略）

　　与GalHSA5FU作用24h的IC50值比较，**P<0.01，#P>0.05。
   
　　2.2  细胞周期检测结果
   
　　药物作用24h后各质量浓度（3.812、7.625、15.250mg·L-1）的GalHSA5FU对细胞周期均有明显影响，与对照组相比，表现为G2/M期明显减少，S期相对增多，且随着GalHSA5FU质量浓度的增大，S期细胞继续增多。这说明GalHSA5FU 阻滞Bel7402于S期。15.250mg·L-1 5FU作用24h后，与同质量浓度GalHSA5FU相比，对细胞周期改变不大。详见表3。
   
　　表3  GalHSA5FU 作用24h对Bel7402 细胞周期的影响（略）

　　2.3  荧光染色结果
   
　　对照组及用药组均偶见凋亡细胞，凋亡率见表4，说明GalHSA5FU并不诱导Bel7402细胞凋亡。
   
　　表4  Hoechst 33258荧光染色检测凋亡率（略）

　　3  讨论
   
　　去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)仅存在于哺乳动物的肝细胞膜，能特异识别具有半乳糖基的蛋白形成受体配基复合物，内吞入肝细胞后经溶酶体降解为配基和ASGPR，且ASGPR不进一步被降解，重新被转运到细胞浆膜上，参与下一轮循环。将药物与ASGPR所能识别的载体相结合研制肝靶向药物，可使药物选择性的导向肝细胞，达到提高疗效、降低副作用的目的。Hashida等［9］通过模型比较了几种肝靶向的途径，认为经去唾液酸糖蛋白受体介导途径最好，该系统对肝有较高的亲和性，且肝吸收迅速。利用半乳糖酰化的大分子载体可以模拟去唾液酸蛋白，达靶向目的。
   
　　本实验结果表明，用不同质量浓度的GalHSA5FU处理人肝癌细胞（Bel7402）24、48、72h，细胞生长增殖明显受到抑制，且具有时间及剂量依赖性。相同质量浓度的GalHSA5FU与5FU作用24h，其抑制肿瘤细胞增殖能力差异无统计学意义，推测是由于药物经主动摄取进入肝细胞，仍通过解离释放5FU而发挥药效，从而可见GalHSA5FU虽然分子结构改变，但进入肝细胞后依然是通过解离出5FU而发挥药效，抗肿瘤活性并未受影响。

在细胞增殖周期中，在G1期和S期之间以及G2期和M期之间，存在着影响细胞周期进行的控制点，而药物可能通过调控这些控制点来影响细胞增殖。不同的化疗药物可影响细胞周期的不同阶段。Lee等［10］研究发现5FU阻滞喉咽癌细胞PNUH12于G1期；Espinosa等［11］报道5FU通过增加cyclin D1和cdc2的表达而使人乳腺癌MCF7细胞阻滞于S期。在本文中，GalHSA5FU阻滞细胞于S期，可见G2/M期明显减少，而相同质量浓度的5FU对周期改变不明显，提示相同剂量GalHSA5FU具有较好的抗肝癌活性。当细胞核DNA由内在或外在的因素损伤后，正常细胞会在细胞周期的某一检查点上停止运行。DNA受损的细胞通过以下方法避免DNA复制：停滞在G1期；或者是在细胞已经通过G1期的限制点后，通过抑制复制子的起始或延伸，暂时停滞在S期［12］。推测GalHSA5FU作用Bel7402细胞后，DNA受损的细胞已经通过G1期的限制点，暂时停滞在S期，以此来避免DNA复制。
   
　　Jiang等［13］研究发现，5FU能诱导人肝癌细胞Bel7402凋亡，当LArg存在时，凋亡率会上升；另有研究表明，5FU诱导p53和p21(WAF1/CIP1)依赖的G1期PNUH12细胞周期阻滞，而不诱导凋亡［10］。本文的流式细胞仪检测及荧光染色结果都未显示凋亡。同时为证实这一结果的可靠性，我们连续进行3次实验均得出未显示凋亡的相同结果，但GalHSA5FU究竟是通过何种机制抑制Bel7402细胞增殖还有待进一步的研究。

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