阻塞性胆汁淤积大鼠肝细胞MRP3与Lrh-1蛋白表达的关系

作者：吴晓平    作者单位：第三军医大学附属西南医院，重庆 400038

【摘要】  目的 通过建立梗阻性黄疸动物模型，在蛋白水平观察多耐药相关蛋白MRP3(multidrug resistance-associated protein3，MRP3)和核受体Lrh-1（liver receptor homologue-1）表达变化并分析二者之间的关系。方法 胆总管结扎术法制备大鼠梗阻性黄疸模型，检测肝功能；提取大鼠肝细胞膜蛋白与核蛋白，测定提取液蛋白浓度；采用Western blot技术检测MRP3和Lrh-1蛋白表达。结果 梗阻性黄疸大鼠总胆红素、直接胆红素显著升高，白蛋白显著降低；与假手术对照组相比，梗阻性黄疸组大鼠肝细胞MRP3和Lrh-1蛋白表达明显升高(P值 分别为0.027和0.046)，差异有统计学意义。结论 MRP3表达上调可能与Lrh-1激活有关，Lrh-1蛋白可能对MRP3蛋白表达有正性调控作用。

【关键词】  多耐药相关蛋白 核受体 黄疸 阻塞性 胆汁淤积 大鼠模型

    Relationship between hepatic membrane protein MRP3 and nuclear receptor Lrh-1 in obstructive cholestasis        WU Xiaoping*， CHAI Jin*， HE Yu， et al. * Gastroenterology Research Center， Southwest Hospital， the Third Military Medical University， Chongqing 400038

    Abstract   Objective  To investigate the relationship between membrane protein MRP3  (multidrug resistance-associated protein 3) and nuclear receptor Lrh-1 (liver receptor homologue-1) in bile duct ligated (BDL) rat  liver. Methods  Physiological and biochemical parameters of the blood were determined to detect liver function. Membrane protein and nuclear protein were isolated from the liver tissue of BDL rats. The protein expressions of MRP3 and Lrh-1 were determined with Western blotting. Results  Total bilirubin (TB) and direct bilirubin (DB) increased， but albumin (ALB) decreased. In BDL rat liver， the membrane protein MRP3 and Lrh-1 expression were all significantly up-regulated. Conclusion  The up-regulation of hepatic membrane protein MRP3 may be associated with up-regulation of nuclear receptor Lrh-1. There may be positive correlation between them.

    Key words   multidrug resistance-associated protein； liver receptor homologue； jaundice， obstructive； cholestasis； rat model

    胆汁淤积是指胆汁的生成和(或)胆汁内溶质排出障碍，一些正常从胆汁中排泄的物质如胆酸、胆红素和胆固醇在血液内异常堆积。胆汁淤积可由肝内外胆管梗阻或肝细胞分泌胆汁方式的改变所引起。目前发现多种酶参与了胆汁酸循环，多耐药相关蛋白MRP3(multidrug resistance-associated protein3，MRP3)即是其一，它参与肝细胞至血液的胆酸转运。Lrh-1是一种核受体，已有报道RXRa等核受体对MRP3的转录表达起重要的调控作用[1]，Lrh-1是否参与了MRP3基因的表达调节尚少见报道。为此，本实验对梗阻性黄疸肝细胞中上述两种蛋白的表达相关性进行了初步观察，以期为进一步研究MRP3基因转录调控机制提供有益的线索。

    1 　材料与方法

    1.1 　材料  Mem-PER膜蛋白抽提试剂盒和NE-PER核蛋白抽提试剂盒(Pierce Biotechnology)；SDS-PAGE凝胶试剂盒（北京赛驰生物）；MRP3、Lrh-1、β-actin（β-肌动蛋白）、SH-PTP1（酪氨酸磷酸酯酶）四种一抗和羊抗鼠、羊抗兔IgG-HRP两种二抗均购自Santa Cruz公司；健康雄性Wistar大鼠24只，质量260～300 g，由第三军医大学实验动物中心提供。

    1.2　 方法

    1.2.1　 动物分组及模型制备　　Wistar大鼠用数字表随机法分为2组：梗阻性黄疸(BDL)组12只、假手术对照组(SHAM) 12只。所有大鼠手术前禁食12 h。BDL组以2.5%戊巴比妥钠腹腔麻醉，剑突下纵形切口进腹，沿肝十二指肠韧带找到胆总管，在十二指肠上方丝线双重结扎切断胆总管[1]。SHAM组仅游离胆总管而不予结扎切断。术后7 d两组大鼠麻醉后放血处死，获取肝脏并立即冻存于液氮备用。

    1.2.2　 肝功能检测  分别于术前和术后第7天采血，用7020型日立自动生化分析仪检测血清总胆红素(TB)、直接胆红素(DB)和白蛋白（ALB）。

    1.2.3　 组织膜蛋白与核蛋白的提取  MRP3是一种膜蛋白而Lrh-1是一种核蛋白，二者分别用Mem-PER 膜蛋白抽提试剂盒和NE-PER核蛋白抽提试剂盒提取，具体操作按试剂盒说明书进行。用Bio-Rad核酸蛋白仪测定提取液的蛋白浓度，之后提取液放入-70 ℃保存备用。

    1.2.4　 Western blot检测组织中膜蛋白MRP3的表达  取膜蛋白100 μg与等体积上样缓冲液混匀，直接上样，7.5% SDS-PAGE电泳分离，然后电转移至硝酸纤维素膜，丽春红染色确定上样的均一性和电转移效率，然后用含2%脱脂奶粉的PBST室温封闭2 h，加入一抗(1∶100) 4℃孵育过夜，用PBST洗去一抗后加入二抗( 1∶2 000)，室温孵育2 h。MRP3免疫印迹所用的同一硝酸纤维素膜上免疫复合物经洗脱以后，再与另一胞浆蛋白β-actin抗体孵育，Western blot检测β-actin并以此条带确定上样量。DAB 显色后于凝胶成像系统照像记录，然后用Quntity one分析软件测定目的条带的负相光密度。实验重复3次，表达蛋白定量水平用目的条带负相光密度值表示。

    1.2.5　 Western blot检测组织中核蛋白Lrh-1的表达  用SH-PTP1蛋白作内参。取Lrh-1蛋白20 μg与等体积上样缓冲液混匀，100℃加热5 min变性，冷却后上样，12% SDS-PAGE电泳分离，余下步骤除一抗、二抗及SH-PTP1三种试剂外，操作同MRP3检测。

    1.2.6 　统计学方法  数据用均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 10. 0统计软件行方差分析和t检验。

    2  结果

    2.1 　梗阻性黄疸模型观察  胆总管结扎术后第7天肉眼见BDL组大鼠皮肤黄染，尿色深黄。与手术前相比总胆红素（TB）、直接胆红素（DB ）显著升高、白蛋白（ALB）显著降低。SHAM组大鼠外观及上述三项指标无明显变化。两组间差异有统计学意义。见表1。

    2.2  MRP3蛋白表达  Western blot结果见图1。2个分组中MRP3条带都较清晰，但BDL组中3组MRP3条带密度都明显增强，β-actin内参条带SHAM组和BDL组较一致。作光密度相对定量分析SHAM组为7.8±3.6，BDL组为17.5±1.8，后者比前者高近1.5倍，差异有统计学意义（P＝0.027），此结果显示BDL组MRP3蛋白表达明显增强。

    2.3  Lrh-1蛋白表达  Western blot结果见图2。2个分组中Lrh-1条带都较清晰，同MRP3，BDL组中3组Lrh-1条带密度也都明显增强，SH-PTP1内参条带SHAM组和BDL组较一致。光密度相对定量分析SHAM组为0.33±0.05，BDL组为0.62±0.03，后者比前者高近1倍，差异有统计学意义（P＝0.046），此结果显示发生梗阻性胆汁淤积时Lrh-1蛋白表达明显增强。

    3  讨论

     胆汁形成是一渗透性分泌过程，肝细胞不断从门静脉血中摄入胆盐等物，再不断主动转运至毛细胆管，吸纳水和电解质形成胆流。胆管梗阻导致胆流排出受阻引起胆汁淤积，淤积的胆汁损伤肝细胞，但在发生这种损伤的同时，肝细胞也可以发生代偿性反应以保护自身[2-3]。由于各种胆汁成分的摄入与排泄都是由分布于肝细胞膜的多种转运蛋白完成，因此这种代偿性反应也多涉及到这些转运蛋白。

    多药耐药相关蛋白MRP是一种膜转运蛋白，属ABC超家族(ATP binding casset tetransporter superfamily，ABC transporter superfamily)，主要转运疏水性不带电荷的分子或水溶性的阴离子化合物。它包括6个家族成员MRP1-6。其中MRP3是一种含有ATP结合域的转运蛋白基因，表达于肝细胞及肾小管、胆管、肠黏膜上皮细胞，是一个典型的有机阴离子运载体，同MRP2相似，可转运胆酸、17β-雌二醇和一些抗癌药等。MRP3主要集中在肝细胞的基底外侧膜区域，在正常肝细胞的基底侧膜上表达量很低或不表达，但在梗阻性胆汁淤积、Dubin-Johnson综合征等一些病理条件下表达可发生变  化[4]。本实验中胆管梗阻肝脏的肝细胞MRP3蛋白表达明显升高，表达量几乎是未梗阻对照组的1.5倍，这种变化与本人另外实验中MRP2的变化正好相反。一般认为，对于肝细胞来说这是一种自身保护机制：当出现胆汁淤积时，由MRP2参与的肝细胞向毛细胆管排泌胆酸的正常通道受阻，小管面的表达下调，而肝细胞则寻求另外的通路排泌细胞内聚积的胆酸盐，即血管面的MRP3表达上调，将胞内聚积的胆酸排泌到血液中，最后通过肾脏排出体外。

    对于胆汁淤积状态下MRP3表达上调的分子机制目前尚不清楚，最近研究表明除了TNFα、IL1β等细胞因子[5]外，RXRa等核受体也参与其中[1]。核受体是一个转录因子的超家族，在结构上都含有一个DNA结合结构域和配体结合结构域，可与其配体和靶基因上游DNA调控序列结合，参与靶基因的转录调节。作为核受体之一，Lrh-1也已被证明参与胆汁酸的调节活动，其是一种单体孤儿受体， 主要在卵巢、小肠和肝脏表达，是一种组织特异的感应因子[6]，在MRP3基因上游启动子调控区可与顺式元件特异性结合[3]。本实验中，MRP3表达上调，同时Lrh-1表达也上调。这是否可以认为MRP3表达上调与Lrh-1表达上调有关？Lrh-1可以特异性结合于MRP3基因启动子调控区，二者的表达又具有同步性，因此我们考虑Lrh-1表达对MRP3的表达具有正性调控作用。作为一种现象分析，这种推测在纷繁复杂的基因转录表达调控中是必要的，确证还需做进一步的工作。

【参考文献】
[1] 李琼，陈文生，罗东林，等. 阻塞性胆汁淤积大鼠肝细胞膜蛋白MRP3与核受体RXRα蛋白表达关系的研究[J]. 第三军医大学学报，2006，28（12）：1298-1300.

[2] Carlton VE， Pawlikowska L， Bull LN. Molecular basis of intrahepatic cholestasis[J]. Ann Med，2004，36(8)：606-617.

[3] Bohan A， Chen WS， Denson LA， et al. Tumor necrosis factor alpha-dependent up-regulation of Lrh-1 and Mrp3(Abcc3) reduces liver injury in obstructive cholestasis[J]. J Biol Chem， 2003，278(38)：36688-36698.

[4] Kullak-ublick GA， Stieger B， Meier PJ. Enterohepatic bile salt transporters in normal physiology and liver disease[J]. Gastroenterology，2004，126(1)：322-342.

[5] Keitel V， Burdel S， Warskulat U， et al. Expression and localization of hepatobiliary transport proteins in progressive familial intrahepatic cholestasis[J]. Hepatology，2005，41(5)： 1160-1172.

[6] Nitta M， Ku S， Brown C， et al. CPF： an orphan nuclear receptor that regulates liver specific expression of the human cholesterol 7alpha-hydroxylase gene[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(12)：6660-6665.