体外诱导乳房内脂肪来源干细胞向上皮细胞分化的实验研究

21世纪初，Patrick等[2]首次将组织工程技术引人乳房填充和重建领域，选择和获取合适的种子细胞是开展乳房组织工程研究的第一步。乳腺在细胞水平由肌上皮细胞和管腔上皮细胞构成，两者都起源于乳腺干细胞(mammary stem cells, MaSCs) MaSCs是成体干细胞的一种[3-5 ]，但因难以分离、纯化而使其应用受到限制。我们的前期研究结果表明，可成功从人肥大乳房乳腺脂肪组织中大量获取人乳房脂肪来源干细胞(human breast adipose- derived stem cells,hbASCs) [6]，其与Zuk等[7]发现的 ASCs具有相似的生物学特性。ASCs已被证实可向骨、软骨、脂肪、心肌细胞等多胚层定向诱导分化吕，但是否可向乳腺上皮细胞诱导分化尚鲜见相关报道。我们拟通过膜孔径为0.4 pm的 Transwell共培养系统模拟乳腺发育生理环境，以观察hbAScs向乳腺上皮样细胞诱导分化的能力。

材料与方法

一、材料 人正常乳腺上皮细胞株H B L-100购于武汉博士德生物工程有限公司，编号:CX0129HBL-100480 hbASCS来源于华中科技大学附属协和医院整形外科就诊的健康成年乳房肥大女性切除的乳房组织内脂肪组织。实验方案经由华中科技大学药物临床试验伦理委员会审批，符合《世界医学大会赫尔辛基宣言》，术前均征得患者知情同意。

二、主要试剂和仪器 DMEM/F12 medium(武汉博士德生物工程有限公司);胎牛血清(FBS , Gibco公司，美国);兔抗人 Cvtolceratinl8 , 19、兔抗人Cytokeratinl8 FITC ( Gene TeX公司，美国);普通和Transwell ( 3460培养板 ( Cornig公司，美国)。

三、细胞分离与培养

(一)hbASCs的分离培养及鉴定:参照Zuk 等r}酶消化+贴壁法从人肥大乳房乳腺脂肪组织中分离、纯化、扩增hbASCs，检测所得细胞CD34 , CD44 , CD45及CD105表达情况，并鉴定其成脂、成骨的分化能力。

(二)人正常乳腺上皮细胞系H B I.-100的培养: HBL-100是人整合SV40基因的非癌性永生化乳腺上皮细胞株’将其置于完全培养基(DMEM/F12 +10%FBS+1%双抗)培养至90%融合后，消化法传代，取传代后生长良好细胞备用。

(三)hbASCs与HBL-100细胞Transwell共培养诱导:分别取第3代hbASC;和HB L-100细胞在无血清的DMEM/F12 + 1%双抗环境下培养1d，通过血清饥饿法使2种细胞生长趋于同步化((}} 期)。实验组取同步化后hbASCs.按1 x 10'密度接种于预置无菌盖玻片的12孔Transwell下室中，将Transwell上室置于孔中I=室内接种HBL- 100细胞，并调整细胞量与下室hb ASCs相同，确定上、下室培养液互相融通并封盖，从而建立起 hb.4SCs与HBL-100细胞共培养体系;对照组 Transwell双层培养皿上、下室均接种同实验组等量相同来源的hbASCs组细胞均置于37℃ ,5% CO2恒温细胞培养箱中培养，隔日换液。

(四)相差显微镜下观察细胞形态变化:每日用倒置相差显微镜观察上、下室中细胞状态，并记录各组下室细胞形态变化及生长情况。

(五)免疫荧光细胞化学染色:共培养诱导15d 后，将2组下室细胞爬片取出，经过免疫荧光细胞化学基本处理后，进行乳腺上皮细胞特异性表面标志物CK18 、 Ck19检测，置于倒置荧光显微镜下，200 倍镜下随机选取5个视野，计算总细胞数和阳性细胞数。 阳性率=阳性细胞数/总细胞数x 100%.

(六)超微结构观察:取共培养后15 d2组下室细胞，分别消化后离心，将细胞沉淀以2. 5%戊二醛固定，4℃过夜后用PBS冲洗，再以1 070饿酸4℃固 定1h，丙酮梯度脱水，环氧树脂Ep0812包埋，切片机常规超薄切片，醋酸铀构椽酸铅染色，透射电子显微镜下观察、照相。

(七)统计学分析:采用SPSS 13. 0软件，两独立样本t检验检测阳性率，P < 0. 05为差异有统计学意义。

结果

一、hbASCs的鉴定 原代hbASCs在接种后24 h即可见多数细胞贴壁生长，形态呈扁平短梭形或小多角形，视野下可见散在油滴;48 h后，细胞伸展出细小突起，分裂增殖，体积增大，呈宽而长的梭形。培养6d后细胞排列极性明显，呈漩涡状，为典型的成纤维细胞样生长;传至第3代后，细胞形态较均一，呈宽、长梭形，细胞体积较大，极性明显，呈漩涡状排列，高倍镜下可见胞浆丰富，染色质细，核仁明显，有颗粒积聚。传代10代以上hbASCs、仍保持旺盛的增殖能力，细胞形态未见明显改变，米发生明显衰老死亡现象，与文献中描述MSCs-〕和其他部位脂肪来源ASCs[4] 生长方式一致(图1)。免疫荧光结果显示hbASCs 同ASC、和MSC、一致，可阳性表达CD44 ,CD105，提示其具有间充质干细胞特性;不表达CD34 , CD45 , 证实其非造血系细胞分化而来，Vimentin阳性细胞比例达95 %以上，呈强阳性表达，表明本实验方法获得的细胞均起源自中胚层，属间充质细胞，无其他胚层来源细胞污染图2).hbASCs经成脂诱导 21 d后，镜下诱导组可见大量细胞胞浆内出现多房性脂滴积聚，并出现汇合现象，折光性强，形态接近成熟脂肪细胞的脂滴结构，油红染色呈强阳性; 经成骨诱导21 d后，可见大量深褐色、黑色钙结节形成，茜素红染色呈阳性红色，对照组均呈阴性(图 3)，证实hbASCs具有多胚层分化能力。

二、相差显微镜观察细胞形态变化 共培养后，实验组Transwell下室中细胞增长迅速。共培养至7d时，可发现部分下室细胞开始逐渐收缩，体积缩小，至21d时可见由原来的成纤维细胞长梭形逐渐变为多角形、类圆形或不规则形等，轮廓清晰，细胞排列极性不明显，呈铺路石样，类似乳腺上皮细胞样外观。高倍镜下可见细胞间连接紧密，细胞核呈圆形，核内可见丰富颗粒存在(图4); 对照组下室hbASCs细胞仍呈长梭形、漩涡状极性排列，增殖速度较前无明显改变(图5)。

三、免疫荧光细胞化学染色结果 实验组下室细胞爬片经免疫荧光化学染色后，部分细胞可阳性表达乳腺上皮细胞特征性表面标志物CK18 , CK19呈红色荧光)，提示该部分细胞经共培养诱导后已分化为具有乳腺上皮细胞表型的上皮样细胞;对照组下室细胞爬片CIC1歇CK19表达阴性 (图6)。实验组CK1歇CK19阳性率分别为(24. 4士 I2. o)%和(21. 6士16.4)%;对照组分别为(1.s士1.7%和(1.1士 0.6)%,2组比较差异有统计学意义(n=5，P<0.01)。

四、超微结构观察结果 透射电子显微镜下，可见实验组下室细胞经诱导后细胞体积缩小，细胞器明显丰富，细胞核由原来的不规则形状变为圆形，核周围可见张力丝结构，细胞间可见桥粒连接等上皮细胞特征性结构(图 7a,b)。对照组中未见上述改变。

讨论

合适的种子细胞的选取，一直以来都是乳腺组织工程的热点和难占_乳腺胡织角乳娘 1-方细驹构成，体外培养原代乳腺上皮细胞常被大量混杂的成纤维细胞所抑制，即使获取纯化后的乳腺上皮细胞，体外培养时细胞增殖和生存时间也有限，会迅速出现细胞老化、凋亡，细胞表型难以维持。有学者曾提出联合应用雌二醇和孕酮可增强去势小鼠乳腺上皮细胞增殖，但仍难以满足组织工程技术对种子细胞的要求。 乳腺干细胞(MaSCs)是在肥大乳腺组织中分离得到的一种成体干细胞，已被证实其具有自我分化和增殖的能力，可分化为乳腺各种上皮细胞及形成乳腺腺体结构，理论上可用作乳房组织工程的种子细胞，但由于存在分离困难、成功率低、难于控制分化等缺陷，限制了其在组织工程学领域的应 用和发展。hbASCs因其具有取材丰富、易分离、体外培养可快速增殖、免疫原性低、可进行异体移植，无伦理道德争议等优势在组织工程学研究中具有极大的应用前景。生理环境下hbASCs与MaSCs处于同一微环境中，两者的分化能力是否具有相似性尚无相关研究报道。在干细胞定向诱导分化的研究中，传统的诱导方法往.往需要在培养体系中加人大 量的细胞因子，诱导成木高昂，可能引起机体的全身反应，难以应川于临床。为避免上述不足，近年来该 领域的热点是通过将成熟体细胞与干细胞共同培养以达到诱导干细胞向该种成熟体细胞定向分化的目的。这种共培养的诱导方法，被认为是组织工程领域的一种新兴技术，是未来发展的方向，已有多位学者应用不同的共培养技术在体外成功将动物或人的成体干细胞向肝细胞伙胃细胞、心肌细胞[24]、肺上皮细胞[25]等体细胞定向诱导分化。

本研究中，我们选取人正常乳腺上皮细胞系 HBL-100作为成熟体细胞，通过Transwell系统 (TYPE 3640 Corning, USA)在体外对hbASCs进行定向诱导分化，成功建立了hbASCs和H B L-100细胞的Transwell非接触共培养体系，研究中使用的分隔聚酷膜孔径为0. 4 N m，杜绝了上、下室间细胞的迁移污染避免细胞间的直接接触，使得2种细胞 间仅能通过可弥散的生物活性因子的移动交换相互作用，在一定程度上模拟了体内乳腺发育阶段的微环境。共培养7d后即可观察到实验组hbASCs增殖迅速，体积缩小，15d时部分细胞变为类圆形，排列极性消失，呈铺路石状。透射电子显微镜下观察超微结构，实验组可见诱导后部分细胞胞浆内细胞器增多，细胞核变成圆形，出现微绒毛、张力丝和桥粒连接等类上皮细胞特征性结构表现。应用免疫荧光细胞化学染色检测示部分细胞可阳性表达乳腺上皮细胞特征性表面标志物CICI8,CK19。上述结果说明在体外存在HBL-100细胞的微环境诱导下，经过Transwell非接触共培养后，hbASCs发生了乳腺上皮样改变，具有向乳腺上皮细胞分化的潜能。 目前发生上述改变的确切机制尚不明确。多数观点认为干细胞的分化方向与微环境“壁皇”密切相关L26。通过共同培养，将hb ASCs置于乳腺上皮细胞生长的微环境中，可能促使hbASCs的某些向乳腺上皮细胞分化基因开放，并能表达相关蛋白，从而使其直接分化为乳腺上皮细胞。该方法无需添加生长因子，更为经济，临床应用更为安全，是未来发展的方向之一，但这种方法的主要缺点是诱导分化率较低。

综上所述，本研究结果仍处于初步阶段，仅能表明经与HBL-100细胞共培养诱导后hbASC、向乳腺上皮样细胞发生一了转化，尚不能说明hbASCs已分化成为具有完全乳腺上皮细胞特征和功能的细胞，而且目前诱导转化效率较低，如何稳定高效地使 hbASCs定向分化为乳腺上皮细胞尚需进一步研究。本研究将为乳房相关组织工程学研究提供一种新的思路和理论基础。

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