notch基因在人瘢痕疙瘩间充质干细胞中的表达

Notch基因发现于1919年，因其突变体造成果蝇翅膀缺口(Notch)而得名。Notch信号通路是动物进化过程中高度保守的细胞间信号传导通路，对于维持干细胞的未分化状态极其重要，调控着干细胞的增殖、分化和凋亡。哺乳动物共发现了4个 Notch同源体，包括Notchl , Notch2 , Notch3 , Notch4 ‑ 2008年Moo。等[5], Zhang等先后在人瘤痕疙瘩中分离出干细胞，因其表达间充质干细胞表面标志，故将其命名为癖痕疙瘩来源的间充质样干细胞。但关于其生物学特性，尤其是Notch自我更新基因是否在瘫痕疙瘩间充质样干细胞中表达，国内外尚未搜索到相关文献报道。本实验参考Zhang等所报道的方法分离人瘫痕疙瘩间充质样干细胞，研究 Notchl -4基因在人瘫痕疙瘩间充质样干细胞中的表达，探讨Notch信号通路是否参与瘫痕疙瘩的形成.

材料与方法

一、一般资料

收集2009年10月至2012年10月于遵义医学院附属医院烧伤整形外科行整形手术切除的瘫痕疙瘩6例，男3例，女3例，年龄7一18岁;瘫痕疙瘩均为创伤后0.5 -1年左右形成的病变组织，分别来自耳垂、前胸、腹股沟;经患者知情同意后，无菌收集手术切除后的样本，收集后2h内进人实验程序。实验在贵州省细胞工程重点实验室完成。

二、主要试剂

低糖-DMEM培养基、HBSS缓冲液、胎牛血清、 L-谷氨酞胺、双抗、非必需氨基酸、2-琉基乙醇购于美国Invitrogen/Gibco公司;I型胶原酶,II型中性蛋白酶、Dnase I、0. 25 %胰酶(含EDTA)、小鼠抗人胚胎蛋白4(Oct4)单克隆抗体，地塞米松、抗坏血酸，p一甘油磷酸钠(日-GP)购于美国Sigma公司; 小鼠抗人角蛋白19单克隆即用型抗体、小鼠抗人波形蛋白单克隆即用型抗体、二步法抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒购于基因科技上海有限公司;小鼠抗人单克隆荧光标记抗体CD29-PE , CD34-PE , CD44-FITC } CD90-FITC , CD45-PerCP购于美国BD 公司;RT-PC R引物设计合成于上海捷瑞生物工程有限公司;逆转录试剂盒、RT-PCR扩增试剂盒购于宝生物工程(大连)有限公司;实验所使用其他试剂 均为国产或进口分析纯。

三、方法

(一)人瘫痕疙瘩间充质样干细胞的分离、培养 在严格无菌的条件下，将瘤痕疙瘩标本剪成 2 cm x 3 cm大小，收集至含有双抗的LG-DMEM培养基内，用HBSS液洗涤3次后切割成4一6 mm长的组织片，用3 mg/ml }型中性蛋自酶4℃下消化过夜。剥离并弃除表皮，将真皮部分剪切为1 mm x 1 mm x 1 mm组织块，37 0C 4 mg/ml I型胶原酶消化2h。加人5 U/N‑1 Dnase I作用1 min，终止消化。所得细胞悬液离心5 min ( 1 000 r/min,离心半径 155 mm，离心参数下同)，重悬细胞经200目孔径的细胞滤网过滤，收集滤液离心，增殖培养基(含10% 胎牛血清的低糖DMEM培养基，添加1%双抗、 2 mmol/L L一谷氨酞胺、100 mmol/L非必须氨基酸及 550 N,mol/L 2-琉基乙醇I 5-G)再悬浮，并转人25 cm 组织培养瓶(矩形，斜颈，长x宽=5 cm x 5 cm ) , 置于37 0C , 5% COZ，饱和湿度条件下培养，24 h后更换新的培养基。待原代培养的瘤痕疙瘩间充质样干细胞连生达90%后，HBSS洗涤，0. 25 %胰蛋白酶 (含1 mmol/L EDTA)消化后，离心5 min。增殖培养基重新悬浮，按1 x 104/c耐的细胞密度传代接种，每隔3d换液1次。

(二)流式细胞术检测原代和第3代瘫痕疙瘩间充质样干细胞表型 收集目的细胞，加人PBS震荡成细胞悬液，分装到制备管中，直接加人小鼠抗人单克隆荧光标记抗体，室温避光孵育20一25 min，加人PBS震荡洗涤，离心去上清，加人200闪多聚甲醛固定液，4℃ 放置，待上机分析，采用小鼠抗人的IgG作为同型对只砚。

(三)免疫细胞化学染色 按试剂盒说明在湿盒中进行染色。第3代瘫痕疙瘩间充质样干细胞爬片，96 h后取出，用PBS漂洗后滴加4%多聚甲醛，固定，PBS再次漂洗;1 }a Triton-Xl 00室温作用15 min, PBS漂洗;滴加封闭液，室温作用30 min，不洗;滴加小鼠抗人单克隆抗体(CK-19即用型抗体或波形蛋白即用型抗体或 Oct4抗体，Oct4抗体按1:50稀释;空白对照用PBS 代替一抗)4℃过夜，次日取出复温30 min用PBS 漂洗;滴加鼠、兔通用型二抗，37℃孵育30 rnin，用 PBS漂洗;DAB显色10 s，自来水充分冲洗;苏木素复染10 s ( Oct4抗体不复染)，自来水冲洗，自然干燥后显微镜观察并拍照。

(四)体外诱导瘫痕疙瘩间充质样干细胞向成骨细胞分化 诱导组:收集第1代瘫痕疙瘩间充质样干细胞，以1 x 104/孔细胞数目接种于24孔板内，24 h后弃去培养基，换成1 ml/孔诱导培养液(高糖-DMEM含 10%胎牛血清、10 -7 mol/L地塞米松、50,g/ml VitC,10 mmol/LB-GP)。 对照组:换液成分仅含10% FBS的高糖-DMEM 培养液，余同诱导组。 以上各组于37 ℃ ,5% CO2、饱和湿度培养，每隔3 c1换液1次，用倒置显微镜观察形态变化，第21 天进行茜素红S染色检测钙盐沉积:吸弃成骨细胞诱导液，漂洗，4%多聚甲醛固定，1%茜素红S染色 5 min，显微镜下观察。

(五)实时定量PCR检测瘫痕疙瘩间充质样干细胞Notchl-4 mRNA的表达 上引物设计引物由上海捷瑞生物工程有限公司设计、合成。Notchl F; 5' TGCCAGACCAA- CATCAAC3'R;5'CTCATAGTCCTCGGATTGC3'，扩增片段为192 bp; Notch2 F; 5' GTGTTGACTTCT- GCTCTC 3’R:5‘ACTTCTTCCTCCTAGTACC 3‘，扩增 片段为178 bp; Notch3 F:5’ GTCTTCCAGATTCTCA TCC3’R 5'ATCC ACAGCATTG ACATC3‘, 扩增片段为150 by ; Notch4 F ; 5' GATGTG GATGAGTGTGAGAC 3‘ R:5’CAGGTGG CAGCAATACAG 3'，扩增片段为152 by ; (3-actin : F 5'CACA CCTT CTACAATGAG 3'R: 5’GCTTCTCCTTAA TGTCAC3‘;扩增片段为385 bpo 2.总RNA的提取及Realtime- PCR收集第3代瘫痕疙瘩间充质样干细胞，加人1 ml Trizol，常规方法提取总RNA，检测吸光度A值，计算RNA浓度。10闪体系(含 100 ng总RNA)反转录为cDNA，采用SYBRGreen I染料在Bio- RadiQS荧光定量PCR仪上进行目 的基因的扩增。二步法PCR循环程序:预变性95 0C，30 s;变性95℃,5 s，退火与延伸温度59.5 0C; 共45个循环。以0. 5℃/*变化速度从59. 5℃- 95. 0℃作熔解曲线分析。每个标本均做2个复孔取Ct值的均值。 3.统计学方法采用目的基因Ct值/内参Ct 值进行Notchl-4 mRNA的相对定量分析。相对定量值越低，说明其表达量越高。实验结果用无士、表示，经统计软件SPSS 13. 0进行单因素多组间方差分析.

结果

一、瘫痕疙瘩间充质样干细胞形态与生长特性 原代培养24 h后，有少量细胞贴壁，形态多为三角形、不规则形或卵圆形;48 h后贴壁细胞数量增多，形态多为短梭形或斜鲜状，核大，核仁明显; 3d后贴壁细胞数量迅速增多，形态多为长梭形，呈集落状、放射状或漩涡状生长，第5天时较明显(图 1) ,7一8d细胞汇合率可达90%以上;传代培养的瘫痕疙瘩间充质样干细胞较原代更易贴壁，且增殖速度加快，5一6d细胞汇合率可达90%以上，细胞排列不规则，胞体拉伸，形态多为长梭形，呈网状、集落状、多层状生长(图2)。

二、瘫痕疙瘩间充质样干细胞表型特点 FCM(流式细胞术)分析显示，原代和第3代目 的细胞均高表达CD29,CD44,CD90等间充质干细胞表型，其平均表达丰度依次为C D29 ( 94. 93 %)> CD44 ( 89. 79% ) > CD90 ( 74. 28% );几乎不表达 CD34 (1. 26% ) , CD45 ( 0. 79%)等造血干细胞表型 (图3)。

三、免疫细胞化学结果 免疫细胞化学检测结果显示，瘫痕疙瘩间充质样千细胞表达多能干细胞标志分子Oct4(图4);表 达间充质细胞标志波形蛋白(图 5);不表达上皮细胞标志角蛋白19 ( C K-19 ,图6);用PBS替代一抗的空白对照未见阳性信号(图7).

四、瘫痕疙瘩间充质样干细胞向成骨细胞分化 诱导组瘫痕疙瘩间充质样干细胞随诱导时间的延长逐渐由长梭形变宽变扁、呈多角形，局部细胞聚集成团，形成较大的细胞集落，中央钙化、变黑，周围围绕透亮的盐状结晶 (图8);诱导第21天，茜素红S染色光镜下可见钙盐沉积部位被染成红色，黑色为彻底钙化的钙盐(图 9);对照组瘫痕疙瘩间充质干细胞随培养时间的延长，细胞平铺，逐渐老化。

五、瘫痕疙瘩间充质样干细胞 Notchl-4 mRNA的表达.瘫痕疙瘩间充质样干细胞表达Notchl-4 mRNA (表1)，且Notch2 , Notch3的相对定量值低于 Notchl , Notch4 ( P < 0. OS )，说明Notch2 , Notch3在瘫痕疙瘩间充质样干细胞中的相对表达量高于 Notchl }Notch4(P<0. 05，表2)。

讨论

瘫痕疙瘩属于病理性瘫痕，是整形外科常见的一种以细胞外基质异常积聚为特征的胶原性疾病。临床表现为皮损高出周围正常皮肤、超出原损伤界限呈瘤样增生、伴有不同程度的瘤痒和疼痛，单纯手术切除后易复发等特点，常造成功能障碍和外观受损。瘫痕疙瘩在病因、病理机制、临床表现、诊断和治疗等方面与肿瘤具有相似的生物学特性，故又称良性 皮肤肿瘤[6-8]。继“肿瘤干细胞学说[9]，提出后 AkinO等提出癖痕疙瘩中可能存在干细胞，Moon 等[5] ,Zhang等先后从癖痕疙瘩中分离出间充质样干细胞，表达CD13,CD29,CD44,CD90，纤维结合素、波形蛋白、Oct4，经诱导这种干细胞可以向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞、神经干细胞方向分化[5-6]，但他们均未进一步研究这种干细胞的细胞分子生物学特性，如这种干细胞的自我更新机制、Notch信号通路是否参与瘫痕疙瘩的形成，目前仍未清楚。 本实验收集临床瘫痕疙瘩标本，参考Zhang 等报道的方法分离培养瘫痕疙瘩间充质样干细胞，镜下见原代培养的细胞24 h已开始贴壁，形似成纤维细胞，FCM分析原代和第3代目标细胞均高表达CD29,CD44,CD90等间充质来源的标志，不表达CD34 , CD45等造血干细胞、白细胞表面标志。2 次FCM分析的荧光强度、阳性细胞数、表达丰度变 化不大，说明在传代培养过程中，目标细胞比较稳定，未发生明显分化。Oct4又名POUSFI，是POU家族同源结构域转录因子之一，特异性表达于具有全能性的未分化细胞中，是干细胞自我更新、多能性的标志分子[11-12]，主要表达于胞核。波形蛋白是细胞内的中间丝，是中胚层来源的标志分子，是间充质细胞的典型标志。CK19是细胞内的中间丝，是角质形成细胞的标志分子，是上皮细胞来源的阳性标 志。本实验分离的目标细胞免疫细胞化学显示 Oct4在胞核内呈强阳性表达，波形蛋白在胞质中呈强阳性表达、CK19呈阴性表达，结合FCM分析，可初步推测目标细胞是间充质来源的干细胞。 干细胞的可塑性是干细胞必备的另一个条件。

实验采用含10%胎牛血清、10-7mol/L地塞米松、 50 U g/ml VitC ,10 mmol/L (3-GP的HG-DMEM诱导分化培养体系，诱导瘫痕疙瘩间充质干细胞向成骨细胞分化体外诱导 21 d后可检测到明显的钙盐沉积，茜素红S染色光镜下可见钙盐沉积部位被染成红色，而钙盐沉积则是骨化的有力证据[13]，说明目标细胞已被成功诱导为成骨细胞。据此进一步鉴定目标细胞是瘫痕疙瘩间充质样干细胞。 Notch信号转导通路是一条影响细胞命运的、原始保守的信号转导通路，当Notch的胞外片段与邻近细胞的配体结合后，Notch信号通路就被激活，激活后Notch受体蛋白经过2次水解，释放出游离的Notch蛋白胞内片段(NICD ) , NICD进人细胞核，通过与转录因子CSL家族形成复合物，结合到特定 DNA序列上，调控与细胞增殖、分化及凋亡密切相关基因的表达，从而决定细胞的命运.Notch信号通路参与维持肿瘤干细胞的自我更新，调控其增殖、分化和凋亡，Notch通路激活，促进肿瘤干细胞增殖，抑制肿瘤干细胞分化，Notch通路的持续激活，导致肿瘤干细胞过度增殖，最终形成肿瘤15-16 ] Notch信号也参与了创面愈合过程，从创面中心到边缘，Notch信号分子的表达逐渐增多,提示在正常创面愈合中，Notch信号在早期得到活化，而在创面修复后及时减弱，Notch信号的异常导致创面愈合异常从而形成增生性疲痕，阻断Notch信号可以抑制兔耳增生性瘫痕的形成。在增生性瘫痕和 健康皮肤中，Notchl -3受体表达于角质形成细胞的细胞膜和胞质中，其表达从基底层上方开始，延伸到颗粒细胞层，而在真皮内无明显阳性表达;增生性瘫痕和健康皮肤中均未检测到Notch4受体的表达。本实验参考Zhang等报道的方法去除表皮，分离瘤痕疙瘩病变真皮，PCR结果显示Notchl -4 基因在癖痕疙瘩病变真皮来源的间充质样干细胞中均有表达，而Notch信号在真皮成纤维细胞中并不表达，说明Notch信号通路参与调控瘫痕疙瘩间充质样干细胞的生物学活性。

在正常情况下， N otch信号的功能是使多种不成熟细胞暂时维持在未分化状态，以调节细胞对分化诱导因子的反应，并使未分化细胞保持一定的数量，推测瘫痕疙瘩内 Notch信号通路一方面维持瘤痕疙瘩间充质样干细胞自我更新，保持其一定的数量;另一方面参与调控瘫痕疙瘩间充质样干细胞的增殖。 不同的Notch受体在相同的细胞或同一种受体在不同的细胞中，表达是不同的，各自所起的作用也不尽相同。在神经髓母细胞瘤中Notch2呈高表达，而Notchl表达较低，并且Notchl和Notch2对髓母细胞瘤的作用正好相反，Notchl抑制髓母细胞瘤的生长，Notch2则促进。本实验检测第3代瘫痕疙瘩间充质样干细胞中Notchl -4 mRN A的表达，荧光定量PCR结果显示瘫痕疙瘩间充质样干细胞中 Notchl , Notch4基因的相对表达量较低，N otch2 , Notch3基因的相对表达量较高，而第3代细胞流式检测结果与原代细胞相比表型无明显变化，说明传代细胞未发生明显分化，推测在瘤痕疙瘩问充质样干细胞增殖的过程中，Notch信号转导通路可能主要是由Notch2 , Notch3基因在调控，在Notch2 , Notch3基因占主导的Notch信号通路调控下，瘫痕疙瘩间充质样干细胞不断增殖，最终形成癖痕疙瘩， Notch信号通路可成为临床或实验研究瘫痕疙瘩治疗的潜在靶点.

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