HSP90在离体人真皮成纤维细胞热损伤中的保护作用

　　作者：李德全,黄晓元,龙剑虹,杨兴华　　作者单位：中南大学湘雅医院烧伤整形科，湖南 长沙 410008

　　【摘要】目的： 探讨人真皮成纤维细胞热损伤变性后HSP90的保护作用. 方法：培养的人真皮成纤维细胞在52℃，30 s热水损伤24 h后用免疫荧光观察HSP90表达部位的改变并与正常组比较，用Western Blot 进一步分析正常的FB和热变性的FB在3, 6, 12, 24, 48, 72, 96及120 h时相点HSP90表达量的改变. 结果：用免疫荧光观察到FB热损伤后24 h胞质胞核中出现HSP90高表达. Western Blot显示3 h即有HSP90表达量升高，24 h达到高峰，维持到96 h，120 h恢复到正常. 结果： FB热变性可以引起HSP90异常高表达，HSP90对FB热损伤具有保护作用.

　　【关键词】 成纤维细胞;热损伤;热休克蛋白质90;保护

　　0引言

　　成纤维细胞(fibroblast, FB)是创面修复的主要细胞[1]，在实验中我们发现FB受到热损伤后经过一段时间可以完全“恢复”. 热休克蛋白90(heat shock proteins, HSP90)是广泛存在于真核和原核细胞中的分子侣伴，在蛋白的修复、信号传导中发挥重要作用[2-3]. 但HSP90在FB热损伤后整个恢复过程中的变化却少见报道，本研究以烫伤成纤维细胞为实验模型，结合免疫荧光和免疫印迹深入分析FB损伤后不同时间内HSP90水平表达变化，为临床治疗提供理论依据.

　　1材料和方法

　　1.1材料5 g/L胰旦白酶+0.2 g/L乙二胺四乙(EDTA),DMEM，新生小牛血清，载玻片 20 mL/L小牛血清封闭液，1∶25山羊HSP90一抗(Santa cruz，美国)，FITC标记免抗山羊IgG(H+L) (二抗,武汉博士德)，5 mL/L TritonX 100打孔液，CeLLpticTM ceLL Lysis Reagent (Sigma)，蛋白Marker，马抗人βactin一抗 (Santa cruz，美国)，山羊抗马βactin二抗(Santa cruz，美国).

　　1.2方法

　　1.2.1细胞培养取门诊手术切除的小儿包皮,用生理盐水清洗3次，10 g/L碘伏浸泡5 min，再用生理盐水清洗3次，在含有青霉素(1000万U/L)的生理盐水中剪除皮下脂肪组织和筋膜，将分离后皮肤转移到5 mL锥形瓶中剪成糊状，加入2.5 mL 5 g/L胰蛋白酶+0.2 g/L乙二胺四乙(EDTA),在37℃，1000 r/min恒温器下振荡1.5 h，加含100 mL/L FCS的DMEM 2.5 mL中和胰酶，用100目金筛网过滤，过滤液经1000 g离心10 min，收集细胞，以1×108/L接种于75 mL玻璃培养瓶中， 37℃，50 mL/L CO2孵箱中培养. 24 h后倒置显微镜观察有部分细胞贴壁，更换细胞培养液，更换下来的培养液重新离心获取细胞培养，前3 d每日换液，以后视细胞生长情况3～5 d换液一次，3～4 wk左右可见细胞贴满瓶底，取第5～15代细胞做实验用.

　　1.2.2人皮肤成纤维细胞热损伤反应当细胞生长融合达80%时，用5 g/L胰蛋白酶+0.2 g/L乙二胺四乙(EDTA)消化，配成2×108/L细胞悬液，分为正常组和实验组，每培养瓶中的细胞悬液为4 mL. 正常组培养瓶浸入37℃液平面下30 s，实验组则在52℃浴水中浸泡30 s形成热损伤变性，分别于3，12，24，48，72，96，120 h为时相点收集细胞进行检测，实验重复3次.

　　1.2.3HSP90免疫组织化学荧光检测将正常组和实验组FB分别倒入置有载玻片的六孔培养板中，置于37℃, 50 mL/L CO2孵箱中培养1 d，按常规方法进行免疫细胞化学染色，HSP90一抗，FITC标记免疫为二抗，阴性对照用0.01 mmoL/S PBS代替一抗，其余步骤不变.

　　1.2.4HSP 90 Western Blot 分析首先提取FB中总蛋白，按BCATM Protein Assay kit(Pierce) 说明测定蛋白质浓度，分装后将其置于-70℃待用. 每个样品取30 μg蛋白质加入等体积3×SDS凝胶加样缓冲液中，100℃煮沸5 min，经100 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳后，100 V电转移PVDF膜1.5 h，20 g/L BSA室温封闭4 h,加入1∶2000稀释HSP90一抗(Santa cruz, 美国)，4℃过夜，PBST洗膜，加1∶3000稀释生物素标记二抗(武汉博士德公司)，37℃孵育1 h，PBST洗膜，滴加超敏曝光液(Pierce, 美国)曝光，在GelDoc 2000凝胶成像系统进行显影及行灰度值比较.

　　统计学处理： 所有数据采用SPSS 10.0进行处理,实验数据以目的产物与内参灰度值之比用x±s表示，各组间比较用单因素方差分析.

　　2结果

　　2.1FB热损伤后HSP90免疫荧光检测正常情况下FB中HSP90阳性染色弱，主要分布于胞质中，热损伤24 h胞质内阳性着色显著增强，而且在一些胞核内还出现强阳性着色(图1，2).

　　2.2FB热损伤后HSP90 Western Blot 结果FB热损伤后3 h HSP90的表达即开始升高(x=0.365, n=4, P<0.05)，24 h达到高峰(x=1.031, n=4, P<0.05)，维持到96 h(x=0.732, n=4, P<0.05)，120 h恢复到正常(x=0.10, n=4, P>0.05,图3). 图1正常FBHSP90免疫荧光结果可见阳性荧光较弱,主要分布在细胞质中×100

　　图2FB烫伤后24 h HSP90免疫荧光结果,可见胞质中阳性荧光显著增强,且胞核内也出现较强的阳性荧光×100

　　图3严重烫伤FB HSP90 Western Blot结果

　　3讨论

　　成纤维细胞是创伤修复的主要细胞[1]. 深Ⅱ°烧伤创面处理的研究一直是烧伤界的热点[4]，但深Ⅱ°创面间生态和残存真皮中的损伤的FB变化转归却一直被忽视. 目前国内外还没有一个较好的深Ⅱ°创面FB热变性的细胞模型[5]. Caitlin 等[6]提出了51.5℃，30 s为NIH3T3热变性损伤模型. 我们通过反复预实验，发现52℃，30 s造成的FB热损伤符合细胞变性的形态学特点：胞膜完整，少量微绒毛,胞质中有大量空泡变性,线粒体肿胀,髓鞘样改变,内质网扩张明显,核质比例小,核仁不明显. 经过一段时间后其形态、结构和功能均能恢复. 以往人们对HSP70在损伤中的作用研究较多，但对HSP90在FB热变性的转归中的变化却少见报道.

　　热休克蛋白(heat shock protein, HSP)是一簇在结构上高度保守的多肽，广泛存在于生物细胞中，参与细胞内损伤蛋白的修复，跨膜转运、信号传导，抑制凋亡及促进增殖等[2-3,7-8]. 在应激反应时，无活性的单体热休克因子(heat shock factors, HSF) 聚集成为有活性的三聚体，启动热休克元件(heat shock elements, HSE)基因表达，产生热休克蛋白，发挥“分子伴侣”作用. HSP90是其家族中的重要成员. 根据冬氨酰胺片段大小不同分为α,β两类，两者同源性达84%，以αα,ββ形式存在，其量大致相等，均为胞质蛋白，相比之下，α易受热诱导，β易受有丝分裂影响[9]. 在ATP协助下，HSP90α主要帮助受损蛋白转运、折叠，防止聚集并恢复其正常构象，β与类固醇激素利用有关，当细胞受到激素作用时，原来与类固醇受体功能活性部分结合而维持其无活性稳态的HSP90与之解离，相应的激素配体与受体结合，进入细胞核启动基因表达而发挥作用[10]. 此外，HSP90还可抑制细胞凋亡、促进增殖和影响细胞周期等作用. 细胞内过多或过少的HSP90均不利于细胞的生存[11]. 因此有必要检测细胞模型中HSP90蛋白合成的情况变化并结合细胞应激损伤情况确定HSP90在本实验条件下的作用. 本组免疫细胞荧光反应显示正常FB不表达或弱表达HSP90，而热变性的FB 24 h HSP90表达明显增强，部分细胞核内亦有异位表达. Western Blot显示FB热损伤后3 h即有HSP90表达，24 h达到高峰，维持到96 h，120 h HSP90基本恢复到正常水平. 我们通过透射电镜观察到在FB热损伤后的第1日变性形态学改变最明显，同时Western Blot显示HSP90在该时相点表达最高，这些说明HSP90升高可能对FB热损伤有保护作用，同时，HSP90可以维持到足够的时间，直到热损伤的FB基本恢复.王军平等[12]在研究严重烫伤大鼠肝脏中发现HSP90可以维持到72 h，而我们的实验却发现HSP90可以维持到96 h，一直到120 h才基本消失，这可能也与上述因素有关.

　　综上所述，HSP90在FB热变性恢复过程中发挥重要作用，但FB是通过何种具体的热休克因子表达HSP90?此外，为什么会在核内异位表达，其基因如何表达，表达量在何范围内是有利的，是否确实与类固醇激素或细胞因子有关等[13]?这一切均有待于进一步研究.

　　【参考文献】

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