膜糖蛋白活化、造血系细胞特异蛋白-1磷酸化与脓毒症时血小板

　　作者：孙艳,孙炳伟*　　　作者单位：江苏大学附属医院烧伤整形科， 江苏 镇江 212001

　　【关键词】 脓毒症; 血小板; 膜糖蛋白; 造血系细胞特异蛋白-1

　　脓毒症(sepsis) 是严重创伤、休克及感染后常见的并发症， 进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(MODS)，即便在基础与临床医学研究及重症监护手段高度发展的现代，临床治疗仍然收效甚微，死亡率居高不下。在脓毒症复杂的发病机制中，凝血系统紊乱是死亡率增加的一个重要原因[1-5]。脓毒症是炎症反应和凝血活化的重要刺激因素，凝血活化和炎症反应之间存在明显的交叉反应。炎症通过诱导组织因子(tissue factor，TF)和血管内皮细胞表面白细胞黏附分子的表达，减少纤维蛋白溶解，抑制抗凝系统促进凝血;凝血酶又可刺激炎症反应发生。现在认为脓毒症早期以TNF-α增高、凝血和纤溶激活为特征。脓毒症时产生的多种促炎症因子如TNF-α、IL-1及IL-6等可引起并加重高凝状态。细胞因子增高后可见凝血酶生成的标志物和纤维蛋白原转变为纤维蛋白的标志物显著升高，提示凝血酶生成增加，凝血系统经细胞因子介导而活化。反之，凝血酶、因子Xa、纤维蛋白等凝血因子又可通过刺激单核细胞、内皮细胞释放TNF-α、IL-1及IL-6等促进炎症反应发生。因此，凝血系统的活化与细胞因子形成相互促进的循环，在研究脓毒症的病理生理及治疗时，必须高度重视凝血系统紊乱问题和抗凝策略。

　　血小板活化是凝血系统激活过程中的重要事件，在脓毒症的早期阶段 ，即可发生血小板激活和聚集。血小板在脓毒症所致的多器官功能障碍综合征中扮演了重要角色， 在脓毒症的发生、发展和转归中具有重要作用[6-10]。但血小板在这一综合征中的特殊角色还没有被完全阐明。血小板活化包括3个方面：黏附、聚集和释放，三者相互促进。研究表明，血小板活化反应都是通过其表面重要的膜糖蛋白的功能实现的。脓毒症时凝血系统紊乱明显，血小板异常活化与血小板相关膜糖蛋白和下游信号分子的磷酸化及信号传导异常有密切关系，其中重要的活化信号分子造血系细胞特异蛋白-1(hematopoietic lineage cell-specific protein 1， HS1)[11-12]的磷酸化在血小板活化过程中起着非常关键的作用。因此，研究血小板重要的膜糖蛋白及其调节因子的功能，是探索血小板活化干预措施、有效阻断脓毒症时凝血系统活化的重要环节[13-15]。本文对脓毒症时与血小板活化相关的重要膜糖蛋白及其下游关键信号分子HS1变化的相关研究进展作一综述。

　　1　血小板膜糖蛋白的种类与分布

　　血小板具有黏附、聚集、释放反应等生理功能，在生理上有助于止血和修复损伤的血管内皮，但在脓毒症时，血小板又是凝血和血栓形成的重要因素和核心过程。血小板参与脓毒症时血管的痉挛、血栓形成、栓塞的发生和缺血后组织的迟发性损害等各个环节。血小板膜糖蛋白在这些过程中起着极其重要的作用。

　　血小板膜糖蛋白是血小板膜内、膜表面及血浆中的特定的血小板糖蛋白成分。目前已鉴定出10余种，与血小板黏附(细胞基质) 、聚集(细胞细胞) 、激活密切相关的主要有GPⅠb /Ⅴ/Ⅸ、GPⅡb /Ⅲa、糖蛋白Ⅳ、糖蛋白Ⅵ、蛋白酶活化受体(protease-activated receptors，PARs)、P-选择素等几种。

　　1.1　GPⅠb /Ⅴ/Ⅸ

　　GPⅠb /Ⅴ/Ⅸ复合物[16]是血小板表面的主要膜糖蛋白之一 ， 在血小板黏附与聚集过程中起重要作用，对于维持血小板的形态非常重要。GPⅠb /Ⅴ/Ⅸ包括4种成分：GPI bα(130 000)，GPI bβ(25 000)，GPⅨ(22 000)和GPV(82 000)，它们按2 ∶2 ∶2 ∶1的比例结合成一个相对分子质量为460 000的复合物。静止状态下 GPIb 的胞质区通过肌动蛋白连接 C末端与膜下肌动蛋白细丝相接，具有稳定的三联结构。当血小板受凝血酶等诱导剂活化后，通过切割 GPV 而连接于 GPIb发挥作用。在最初的黏附反应中，血小板GPⅠb/Ⅴ/Ⅸ复合物与血管性假性血友病因子(vWF)结合到内皮下的胶原表面，随后胶原受体α2β1与胶原相互作用，导致血小板激活。其他的黏附受体，包括纤维连接蛋白受体α5β1 和层黏连蛋白受体α6β1 ，支持和强化血小板彼此黏附的过程。

　　1.2　GPⅡb /Ⅲa

　　血小板膜糖蛋白GPⅡb /Ⅲa(β3整合素) [17-18](每个血小板上有6万到10万个，占整个血小板蛋白含量的1%～2% ) ，是介导血小板与纤维蛋白原结合的受体。GPⅡb /Ⅲa是一个杂二聚体，包括α亚单位( GPⅡb、CD41)和β亚单位(GPⅢa、CD61) 。GPⅡb /Ⅲa只存在于巨核细胞和血小板表面， 80%存在于静息血小板表面， 20%存在于α颗粒和开放管道系统(open canalicular system，OCS)中，静息血小板表面的GPⅡb /Ⅲa不能结合纤维蛋白原、vWF因子、玻璃体结合蛋白和纤维连接蛋白。胶原刺激激活血小板后，隐蔽状态的GPⅡb /Ⅲa全部表达到血小板膜表面。同时，血小板活化后GPⅡb /Ⅲa空间构象改变，暴露纤维蛋白原受体结合部位，获得受体活性，并能特异识别各种纤维蛋白上的精甘天冬(RGD)序列及纤维蛋白原γ链的赖谷丙氨酰胺甘天冬缬(KQAGDV)序列，引起血小板聚集。

　　1.3　糖蛋白IV(GPIV)

　　GPIV又称CD36、GPⅢb、PASIV。纯化的GPIV相对分子质量为88 000，每个血小板膜上含12 000个CD36，由cDNA推导出它由471个氨基酸组成。等电点4.4～6.3，呈高度糖基化， 含碳水化合物26%。推断的一级结构中有10个天冬酰胺连接的糖基化可能位点和N端信号肽， C端含类似于CD4、CD8a羧基端胞浆尾序列。GPIV介导血小板与胶原、凝血酶敏感蛋白(TSP) 、血小板凝集蛋白P37结合，也能与感染疟原虫红细胞结合，还介导血小板与巨核细胞及巨核细胞与巨噬细胞的相互作用。CD36缺乏易引起血小板输注无效和新生儿同种免疫性血小板减少症，有些人缺乏CD36，但无明显临床症状。CD36在血小板膜上可与其他成分如CD9， GPⅡb /Ⅲa构成多蛋白复合体，并且这种连接具有较高特异性，需要疏水环境和质膜提供结合位点。因为GPIV 本身具有丰富繁杂的功能，从而受到研究者的关注。GPIV 在血小板黏附到胶原的早期发挥辅助加速的作用。目前有关GPIV 在血小板与胶原相互作用过程中发挥何种功能的研究充满争议。

　　1.4　糖蛋白VI(GPVI)

　　血小板膜糖蛋白Ⅵ(GPⅥ)[19]在介导血小板与胶原黏附、快速信号转导、血小板活化及促凝活性表达等复杂过程中处于中心位置。GPⅥ为Ⅰ型单链跨膜糖蛋白，属免疫球蛋白超家族成员。GPⅥ基因定位于19号染色体长臂(19q13.4)，含有8个外显子，相对分子质量为62 000， 其cDNA 克隆全长1017 bp，编码319个氨基酸残基和20个氨基酸信号肽，分子结构分为胞外区、跨膜区和胞内区。胞外区有2个免疫球蛋白样结构域和含多个糖基化位点的黏蛋白样富含丝/苏氨酸区域，为分子的空间活动提供了一定的柔韧度;位于GPⅥ跨膜区19个氨基酸中第3位带正电荷的精氨酸与免疫球蛋白Fc受体γ链跨膜区的天门冬氨酸残基以盐键相连，组成受体复合物。胞内区含51个氨基酸，不含酪氨酸残基，但含有2个独特序列，一是靠近跨膜区富含碱性氨基酸的区域，能与钙调蛋白结合;另一个是位于中部的富含脯氨酸的区域，可选择性与Src家族酪氨酸激酶Fyn和Lyn的SH3区结合。胶原通过其特异性GPO序列与GPⅥ/FcRγ链受体复合物结合后，使2 个GPⅥ复合物交联而活化。GPⅥ胞内区富含脯氨酸的序列选择性与Src家族酪氨酸激酶Fyn和Lyn的SH3 区结合，使FcRγ链的ITAM磷酸化， ITAM磷酸化为Syk家族酪氨酸激酶提供了结合位点，可特异结合在其串联的SH2区而使Syk酪氨酸磷酸化。拥有多个磷酸化位点的Syk底物，接头蛋白LAT和SLP276 等可募集其他信号转导复合体，引发下游许多效应酶包括磷脂酰C-γ2， 小G蛋白和磷脂酰肌醇3激酶等活化，从而使信号转导级联扩大，导致胞内钙离子浓度升高，纤维蛋白原受体活化，细胞骨架重排，最终血小板发生聚集、释放和促凝活性表达。GPⅥ在体内分布有明显的空间限制性，仅分布于巨核细胞和血小板，在其他组织细胞未见表达，被认为是血小板胶原特异的信号转导蛋白。GPⅥ基因剔除小鼠血小板表现出对胶原刺激无反应，但无明显出血倾向。对GPⅠb /Ⅴ/Ⅸ及GPⅥ功能和信号转导的研究显示两者有许多共同特征，从而推测它们在细胞表面可能相互关联，并在脓毒症血小板活化信号传导过程中发挥重要作用[19]。

　　1.5　蛋白酶活化受体(PARs)

　　凝血系统的激活在脓毒症发生发展过程中有着重大的意义。脓毒症患者的血液往往呈高凝状态，许多凝血因子参与其中。凝血酶作为凝血系统的关键因子，脓毒症时其浓度明显升高，并可被高表达的组织因子(TF)所激活。凝血酶是通过细胞膜上的受体——蛋白酶活化受体(PARs)发挥细胞学效应。PARs是一类七次跨膜G蛋白耦联受体，目前发现有4种PARs，即PAR1、PAR2、PAR3和PAR4。人类血小板主要表达PAR1和PAR4，小鼠血小板主要表达PAR3和PAR4。凝血酶与PARs结合后，引起PARs细胞外N端的降解，重新暴露的PARs的N端与受体本身的细胞外区域结合，从而引发受体不可逆的激活。对人类血小板PAR1和PAR4的比较研究显示，尽管两者都是凝血酶的受体，但 PAR1比PAR4更重要一些，因为单独的Par1缺失，而非单独的Par4缺失，能极大地降低凝血酶反应。PAR4介导的凝血酶的功能与PAR1有所不同;或者功能相同，但机制不同。两者介导的凝血酶功能的不同主要是基于两点： ① 激活两者所需要的凝血酶的浓度不同，激活PAR4需要的凝血酶浓度高于激活PAR1需要的凝血酶浓度;② PAR1激活后能快速而短促地引发细胞内反应，而PAR4激活后是缓慢地引发胞内反应，但反应持续时间较长。这种胞内反应的差异主要是通过受体的内化运输实现的。PAR1被激活后很快在G蛋白耦联受体激酶的作用下，在C端发生磷酸化，磷酸化的PAR1可以通过内吞被溶酶体消化。对小鼠血小板的PAR3和PAR4的比较研究同样表明，PAR3作为凝血酶主要受体，其作用是主要的，而PAR4仅是发挥有限的协同作用。最新研究表明[17-18]，凝血酶蛋白酶活化受体信号通路在脓毒症时血小板活化事件中有着极其重要的地位，目前针对PARs的相关研究尚不多见。

　　1.6　P-选择素

　　P-选择素(GMP140、CD62p)主要存在于静息血小板的α颗粒以及活化血小板的质膜上，也存在于血管内皮细胞棒管状小体(Weibel-Palade)和巨核细胞上。P-选择素也存在于凝血酶激活的中性粒细胞和单核细胞上，并介导此类白细胞聚集到血栓周围。

　　2　造血系细胞特异蛋白-1(HS1)

　　造血系细胞特异蛋白-1(HS1)是一相对分子质量为75 000的适应性蛋白，特异性地表达在造血系细胞。HS1属亲水性蛋白，含有6个磷酸化位点，一个HS1相关蛋白(HAX1)结合位点，一个富脯氨酸区域和一个SH3结构域。在静息血小板，HS1位于胞质中，血小板活化过程中转位至胞膜[20]。目前已证实，Src激酶家族、Syk等主要的血小板酪氨酸激酶是非受体型的。Src激酶家族都包含一个N末端、SH2、SH3、一个催化区和一个自调节C末端区。目前已证实血小板中含此家族的4个成员为fyn、lyn、hck和yes。而Syk激酶的N端有两个SH2区域， C端有一个催化区域。它在结构上类似T细胞特异的酪氨酸激酶ZAP70。Syk位于信号转导的上游。血小板被激动剂刺激， Syk会迅速短暂活化(磷酸化)。但只有Syk活化的刺激， 不足以活化血小板。上述的PARs受体或免疫酪氨酸活化基序(immunotyrosine activating motif， ITAM)受体活化可以引起HS1的397、378和222酪氨酸残基的顺序磷酸化：首先受体活化激活Syk， 后者与HS1结合，导致397、378酪氨酸残基磷酸化;随后，Syk允许Src家族激酶通过其SH2结构域与HS1结合，使HS1的222酪氨酸残基磷酸化。至此，整个HS1被激活，并从胞质转位至胞膜。最新的研究表明[20]，HS1是血小板受刺激后活化过程中的一个关键信号分子，血小板重要的膜糖蛋白(如PARs、GPVI)的活化信号均经HS1而得以传导。

　　2.1　对血小板活化关键信号分子HS1的干预

　　Brunati等[12]在研究血栓素(Thrombin )刺激血小板触发血小板Tyr磷酸化、继而导致血小板活化的研究中，使用Syk 特异性抑制剂piceatannol、Src特异性抑制剂PP2、特异性激酶酪氨酸抗体以及免疫共沉淀方法，发现HS1活化首先是由于Syk的Tyr397发生磷酸化，如果早期抑制了Syk的Tyr397磷酸化，可以有效防止HS1活化，从而阻断HS1移位至细胞膜而发生细胞骨架的重排、血小板活化。但是也有研究者[21]使用HS1基因剔除(HS1-/-)小鼠进行了类似的研究，发现HS1并不在血小板活化过程中起到关键的作用。脓毒症时血小板主要的膜糖蛋白受体PARs、GPVI与下游关键信号分子HS1磷酸化、HS1磷酸化调节激酶的关系目前尚未阐明。因此，研究脓毒症血小板主要膜糖蛋白受体及其下游关键信号分子HS1的磷酸化以及调节激酶(Syk，Lyn等)的系列变化，尤其是相应激酶活性变化对HS1磷酸化的动态调控，探明脓毒症时血小板信号分子顺序活化与调节激酶之间的相关关系，研究HS1磷酸化及重要调节激酶在调节脓毒症时异常血小板活化及信号传导的(部分)分子学基础，进一步发现脓毒症干预的新靶位，显得十分重要。有关HS1磷酸化在血小板活化过程中的作用的相关研究并不多，但是，根据大部分现有的结果，我们可以初步推断HS1在血小板活化中有着一定的介导地位，至少起到部分调节血小板活化的作用，详细的机制尚待更加深入的研究。

　　2.2　外源性一氧化碳分子对血小板膜糖蛋白受体及HS1的磷酸化的调节

　　我们在使用一氧化碳分子干预脓毒症的一系列研究中发现[13]，凝血系统的活化也被一定程度地抑制，这也是脓毒症动物成活率提高的一个重要原因。随后，我们对一氧化碳释放分子干预脓毒症时凝血系统的变化进行了研究[22-23]，尤其对脓毒症时血小板的功能、血小板主要膜糖蛋白的动态变化以及血小板活化信号通路及其关键分子进行了研究，发现① 一氧化碳明显抑制二磷酸腺苷、花生四烯酸和血小板活化因子诱导的血小板聚集，其作用呈现一定程度的剂量依赖关系;② 人血小板经LPS刺激后，HS1的磷酸化水平明显增高，但可被一氧化碳干预有效抑制;增加的血小板膜糖蛋白PAR-1的表达水平也相应下降，血小板活化得到有效抑制。因此我们设想，外源性一氧化碳分子能对脓毒症血小板重要膜糖蛋白受体及其下游关键信号分子HS1的磷酸化以及调节激酶(Syk，Lyn等)等起到一定的干预和动态调控作用，进一步的研究正在进行中。

　　3　展　望

　　作为血小板主要的膜糖蛋白受体，GPVI、PARs和GPⅠb在脓毒症时血小板的活化、聚集和血栓形成过程中起着极其重要的作用。通过干预膜糖蛋白下游重要的信号分子HS1的磷酸化和HS1磷酸化调节激酶(Syk、Sre等)的活性，来影响血小板膜糖蛋白的活化与信号传导，调控血小板的活化过程，可能是干预脓毒症时血小板过度活化的有效方法之一。这也将为脓毒症的研究提供理论依据，为未来临床防治脓毒症提供新思路。

　　【参考文献】

　　[ 1 ]　Grewal PK， Uchiyama S， Ditto D， et al. The Ashwell receptor mitigates the lethal coagulopathy of sepsis[J]. Nat Med,2008,14(6)：648-655.

　　[ 2 ]　Levi M， van der Poll T. Inflammation and coagulation[J]. Crit Care Med,2010,38(2 Suppl)：S26-34.

　　[ 3 ]　Ofosu FA， Dewar L， Craven SJ， et al. Coordinate activation of human platelet protease-activated receptor-1 and -4 in response to subnanomolar alpha-thrombin[J]. J Biol Chem,2008,283(40)：26886-26893.

　　[ 4 ]　Yago T， Lou J， Wu T， et al. Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch bonds with human WT vWF but not with type 2B von Willebrand disease vWF[J]. J Clin Invest， 2008,118(9)：3195-3207.

　　[ 5 ]　Hayakawa M， Sawamura A， Yanagida Y， et al. The response of antithrombin III activity after supplementation decreases in proportion to the severity of sepsis and liver dysfunction[J]. Shock,2008,30(6)：649-652.

　　[ 6 ]　Semple JW， Freedman J. Platelets and innate immunity[J]. Cell Mol Life Sci， 2010,67(4)：499-511.

　　[ 7 ]　Yamamoto H， Takahashi K， Watanabe H， et al. Evaluation of the antiplatelet effects of cilostazol， a phosphodiesterase 3 inhibitor， by VASP phosphorylation and platelet aggregation[J]. Circ J,2008,72(11)：1844-1851.

　　[ 8 ]　Evans DJ， Jackman LE， Chamberlain J， et al. Platelet P2Y(12) receptor influences the vessel wall response to arterial injury and thrombosis[J]. Circulation,2009,119(1)：116-122.

　　[ 9 ]　Blair P， Rex S， Vitseva O， et al. Stimulation of Toll-like receptor 2 in human platelets induces a thromboinflammatory response through activation of phosphoinositide 3-kinase[J]. Circ Res,2009,104(3)：346-354.

　　[10]　Tamura N， Kitajima I， Kawamura Y， et al. Important regulatory role of activated platelet-derived procoagulant activity in the propagation of thrombi formed under arterial blood flow conditions[J]. Circ J,2009,73(3)：540-548.

　　[11]　Kahner BN， Dorsam RT， Mada SR， et al. Hematopoietic lineage cell specific protein 1 (HS1) is a functionally important signaling molecule in platelet activation[J]. Blood,2007,110(7)：2449-2456.

　　[12]　Brunati AM， Deana R， Folda A， et al. Thrombin-induced tyrosine phosphorylation of HS1 in human platelets is sequentially catalyzed by Syk and Lyn tyrosine kinases and associated with the cellular migration of the protein[J].J Biol Chem,2005,280(22)：21029-21035.

　　[13]　Sun BW， Chen X. Carbon monoxide releasing molecules： New insights for anticoagulation strategy in sepsis[J]. Cell Mol Life Sci,2009,66(3)：365-369.

　　[14]　姚咏明，孟海东. 进一步认识活化蛋白C 在脓毒症治疗中的抗炎作用[J].武警医学，2007,18(11)：805-808.

　　[15]　Khan R， Kirschenbaum LA， LaRow C， et al. Augmentation of platelet and endothelial cell eNOS activity decreases sepsis-related neutrophil-endothelial cell interactions[J]. Shock,2010,33(3)：242-246.

　　[16]　沈霖，沈迪，陈瑞，等.出血性血小板病患者凝血酶受体GP Ib/ IX/V复合物表达研究[J].血栓与止血学，2008,14(6)：254-256.

　　[17]　董宁征，崔宇杰，阮长耿. 人源性抗血小板膜糖蛋白IIb/ IIIa Fab抗体的研制及其对血小板聚集功能的影响[J].细胞与分子免疫学杂志，2009,25(1)：65-68.

　　[18]　Coller BS， Shattil SJ.The GPIIb/IIIa (integrin alphaIIbbeta3) odyssey： a technology-driven saga of a receptor with twists， turns， and even a bend[J]. Blood,2008,112(8)：3011-3025.

　　[19]　Al-Tamimi M， Mu FT， Arthur JF， et al. Anti-glycoprotein VI monoclonal antibodies directly aggregate platelets independently of FcgammaRIIa and induce GPVI ectodomain shedding[J]. Platelets,2009,20(2)：75-82.

　　[20]　Kahner BN， Dorsam RT， Kim S， et al. Hematopoietic lineage cell-specific protein-1 (HS1) regulates PAR-mediated ERK activation and thromboxane generation in platelets[J]. Platelets,2008,19(8)：614-623.

　　[21]　Thomas SG， Calaminus SD， Auger JM， et al. Studies on the actin-binding protein HS1 in platelets[J]. BMC Cell Biology， 2007， 8：46.

　　[22]　孙炳伟，石庚生，张萍，等. 外源性一氧化碳释放分子2抑制脓毒症时组织因子的表达[J]. 中华烧伤杂志，2009 ,25(2)：111-114.

　　[23]　杨国涛，孙炳伟，邹向前，等.外源性一氧化碳释放分子对脓毒症小鼠血小板膜糖蛋白CD41、CD61和CD62p表达的影响[J].江苏大学学报：医学版，2011,21(1)：1-4.