川芎嗪对严重烫伤大鼠早期肾脏p38MAPK TNF-α超微结构变化的影响

　　作者：徐庆连,蔡晨,李国辉　　　作者单位：安徽省教育厅自然科学基金项目(2006KJ3578) 230022 合肥 安徽医科大学第一附属医院烧伤科　南昌大学第一附属医院烧伤科(李国辉)

　　【摘要】目的 探讨川芎嗪对严重烫伤大鼠早期肾脏的保护作用与p38MAKP之间的关系。 方法 清洁级成年雄性Wistar大鼠88只，随机分为对照组、烫伤组和川芎嗪组，对照组(0 h)8只;烫伤组和川芎嗪组各40只，后两组又分为1、3、6、12、24 h五个时相点，采用Western blotting方法检测肾脏组织p38MAKP的活化水平，放射免疫法检测肾脏组织TNF-α及血清Cr的含量，电镜观察肾小管上皮细胞的超微结构变化。 结果 与对照组比较烫伤组伤后1 h肾组织p38活化水平明显升高，3 h达峰值(P<0.05)，6 h明显减弱，肾脏组织TNF-α含量在伤后6 h开始增加，12 h达峰值(P<0.05)，24 h仍较高;而反映肾小管上皮细胞超微结构异常变化也是从伤后6 h开始出现，12 h水肿最为严重，血清Cr在伤后1、3 h一过性的升高，其他时点与对照组比较无明显差异，川芎嗪组上述指标要比烫伤组明显下降和减轻(P<0.05)。 结论 烧伤早期肾脏p38活化诱使肾组织TNF-α过度产生、释放，引起肾组织的损伤，川芎嗪通过抑制肾组织p38MAPK活化，从而减少肾脏组织TNF-α的产生，减轻肾小管上皮细胞的超微结构异常变化。

　　【关键词】 川芎嗪;烧伤; p38丝裂素活化蛋白激酶;TNF-α;肾脏损伤;超微结构

　　The effect of Tetra ethyl pyrazine on the p38MAPK, TNF-α, ultrastructure of the renal tissue in rats in the early stage after severe thermal injury　　Xu1 Qinglian, Cai1 Chen,Li2 Guohui　　1 Dept of Burn, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University,230022　　2 Dept of Burn, the First Affiliated Hospital of Jiangxi Medical College,330066

　　[Abstract] Objective To investigate Tetra Ethyl Pyrazine (TMP) blocking of the activated p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) and its protection capability for early stage severe thermal injury kidney in rats. Methods Eighty eight adult health rats were randomly divided into three groups: control group, burns group and burns + TMP group (TMP group). The control group had 8 rats. Forty (40) rats between both the burn group and the burn TMP group, then were respectively divided into five scheduled time points. The five scheduled time points were 1, 3, 6, 12, 24 hours post burn. We checked and measured the activated levels of p38MAPK and the content levels of TNF-αin the renal tissue, the creatinine content level in the serum and change of the ultrastructure of the renal tissue in rats. Reseults Compare the control group with both the burn group and the burn TMP group. The burn group and the burn TMP group have a high activated level of p38MAPK in the renal tissue tested at 1 hour post burn and the highest one occurred at 3 hours(P<0.01-0.05). A high level of TNF-αwas found at 6 hours post burn in renal tissue with the highest one at 12 hours(P<0.01-0.05). The abnormal change of ultrastructure starts at 6 hours with the severe change at 12 hours, but the activated level of p38MAPK, the level of TNF-α, and abnormal change of ultrastructure of TMP group are slighter than that of burn group(P <0.01-0.05). Conclusion These results indicated that the over activated levels of p38MAPK causes injury of the renal tissue in rats after early stage severe thermal injury; TMP protects against kidney injury by the possibility of blocking the activated level of p38 MAPK and content production in the renal tissue.

　　[Key words] TMP; Burn; p38MAPK; TNF-α; Renal injury; Ultrastructre

　　肾功能不全或衰竭的发生率是排在烧伤后多功能脏器损伤的第3位，在严重烧伤早期就可能出现肾脏器质性损伤和功能不全[1]，而这种损伤主要是烧伤后失控性炎症反应所致，p38MAPK激酶的激活在炎性介质的产生过程中起十分重要的作用[2]。丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPKs)级联是细胞内重要的信号传导系统。细胞通过这一系统将细胞外刺激信号传递给细胞核，参与一系列细胞生理/病理过程。哺乳动物有四条MAPK通路，包括细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)通路、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminan kinase，JUK)/应激活化蛋白激酶(stree-activaed protein kinase，SAPK)通路、p38MAPK通路和ERK5/大丝裂素活化蛋白激酶(big MAPkinase，BMK1)通路。JUK/SAPK和p38MAPK通路又被称为应激活化途径，它们一旦被激活即可启动相应的细胞因子、炎症介质，如TNF-α、IL-1等基因转录和翻译，最后导致组织细胞损伤。在肾脏烧伤和缺血再灌注损伤研究中，肾组织p38MAPK大量活化[3，4]，导致肾组织TNF-α的大量产生[5]。TNF-α是细胞因子网络中心之一，它可以引起其他多种细胞因子的释放[6]，引起级联放大效应，产生过多的炎症介质和细胞因子。如何抑止烧伤后p38活化，减少炎症介质和细胞因子对烧伤后肾脏组织损伤是近期研究的一个课题，有研究证实川芎嗪对肾脏缺血再灌注损伤具有很好的保护作用[7]。但是否是川芎嗪通过抑制肾脏组织 p38MAPK的活化，而起到保护烧伤早期肾脏功能，正是本研究的内容。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料、模型制作和取材

　　1.1.1 烫伤模型的制作及取材 清洁级成年雄性Wistar大鼠88只，体重(225±25)g(由安徽医科大学动物中心提供)。随机分为对照组(n=8只)，烫伤组(n=40)和烫伤+川芎嗪组(川芎嗪组)(n=40)。动物领回后饲养1周，致伤前1天背部用10%的硫化钠脱毛。烫伤组、川芎嗪组腹腔注射3%戊巴比妥钠(30 mg•kg-1)麻醉，背部置入92℃恒温水中18 s，造成30%Ⅲ度烫伤，按Parkland公式计算补液量，伤后立即腹腔注射乳酸林格氏液，第一个8 h补一半量，余量在第二个8 h一次输完;川芎嗪组在输液的同时立即腹腔注射川芎嗪[8](20 mg•kg-1•d-1)，批号(0607221)，对照组温水模拟烫伤过程，不予补液。烫伤组、川芎嗪组分别在伤后1、3、6、12、24 h五个时相点(每时点8只)和对照组腹腔麻醉后，取一侧肾上极组织检p38活化水平以及TNF-α含量和超微结构变化，抽静脉血测肌酐(Cr)含量。

　　1.1.2 主要试剂 抗P-p38MAPK抗体购自Santa cruz公司，二抗购自北京中山生物公司，TNF-α放射免疫试剂盒购自天津九鼎医学生物工程有限公司，川芎嗪购于天津金耀氨基酸有限公司。

　　1.2 肾脏组织TNF-α含量检测 肾脏组织100 mg用0.9% NaCl制成10%匀浆液，离心取上清液采用放射免疫法进行检测，按说明操作。

　　1.3 免疫印迹法(western blotting) 检测肾脏组织细胞p38活化水平。

　　1.3.1 组织裂解液的制备 参考文献[9]方法。

　　1.3.2 肾组织蛋白的提取 取实验组各时相点肾脏组织约100 mg，置液氮中压成粉末，然后加入1.0 ml预冷的细胞裂解液，4℃匀浆，4℃ 14 000 g离心30 min，取上清液，置-80℃保存，以Lowry法进行蛋白定量。

　　1.3.3 western blotting法检测 按试剂盒说明书操作，取上述肾组织蛋白提取液，进行12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白(40 μg总蛋白/泳道)，然后转移至硝酸纤维膜上，进行封闭，接着再分别与P-p38的一抗、二抗室温下各孵育2 h和1 h，在暗室中用 X线片感光适当时间，然后冲洗胶片，扫描各样品的蛋白条带的吸光度(A)值，并分别算出与正常对照组吸光度(A)的比值，以求出其表达量和活化倍数。

　　1.3.4 血清Cr含量检测 用Roche-Hitachi7600型全自动生化仪检测。

　　1.3.5 超微结构检测 取1 mm3大小肾组织用2.5%戊二醛和1 %饿酸双固定后，酒精梯度脱水，环氧树脂包埋，切成70 nm超薄片(LKB-NOVA型，瑞典产)，铅、钠双染色，日产JEM-1230型透射电镜观察切片超微结构并拍照作比较分析。

　　1.3.6 统计学处理 所有数据以(x±s)表示，组间差异采用单因素方差分析，所有资料均用SPSS10.0统计软件分析。

　　2 结果

　　肾脏组织TNF-α含量变化：伤后6 h烫伤组肾组织TNF-α含量明显升高，12 h达峰值，24 h仍未恢复正常，与对照组比较有显著差异(P<0.05);川芎嗪组各时相点肾组织TNF-α含量明显少于烫伤组，两者比较差异显著(P<0.05)。见表1。

　　肾脏组织p38(图1)活化水平变化：烫伤和川芎嗪两组伤后1 h p38活化水平显著升高，3 h达最高，6 h下降十分明显，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，但川芎嗪组p38活化水平显著低于烫伤组，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)(见表2)。血清Cr水平变化：与对照组比较伤后1、3 h含量升高，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)，在伤后3 h川芎嗪组Cr含量较烫伤组低，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)(见表3)。

　　肾脏超微结构变化：电子显微镜观察，烫伤组伤后6 h(图2)肾小管上皮细胞水肿、线粒体空泡变，12 h(图4)上述情况最为明显，但是川芎嗪组(6 h为图3;12 h为图5)损伤程度要明显轻于烫伤组组。到24 h烫伤组肾小管上皮细胞无明显水肿，极少数线粒体空泡变，川芎嗪组肾小管上皮细胞基本恢复正常(图6、7)。

　　3 讨论

　　严重烧伤早期即存在肾脏器质性损伤和功能不全。严重烧伤早期可激活多个脏器、组织细胞p38MAPK激酶[2，9]，p38MAPK一旦被激活，即发生核转位，随即启动TNF-α等基因转录和翻译，细胞产生和释放过多的TNF-α。TNF-α是细胞因子网络中心之一，它可以引起其他多种细胞因子的释放，产生级联放大效应，对组织产生损伤[6]。如何调节烧伤后p38MAPK的激活和炎性介质、细胞因子的产生一直是我们研究的课题。有研究证实某些物质可以抑止创伤后TNF-α的产生，如热休克蛋白-72可以阻止缺血诱导的肾小管细胞TNF-α的产生和细胞凋亡[10]。褪黑素和川芎嗪等可以调节创伤后细胞因子的产生，对内脏细胞具有很好的保护作用。

　　川芎嗪是从植物川芎中分离、提纯的一种生物碱，化学名四甲基砒嗪盐酸盐，分子式(C8H12N2•HCL•2H2O)，有抑制TXA2合成酶，使血小板cAMP含量升高，保护血管内皮细胞，抗血小板凝集、抗血栓形成作用，同时还有扩张血管、降低血管痉挛和改善微循环等作用[11]，并可通过改变烧伤早期血浆内皮素和一氧化氮的比值影响血管缩舒功能 [12，13] 。

　　本研究发现严重烧伤后1 h肾脏组织p38大量活化，3 h达最高，6 h后明显减弱;血液中和肾组织TNF-α含量在伤后6 h开始增加，12 h达峰值，24 h仍较高，肾小管上皮细胞超微结构损伤在伤后6 h就比较明显，12 h最为严重，24 h已明显好转，也就是说严重烧伤刺激了肾组织细胞p38MAPK的大量激活，而激活的p38诱导TNF-α基因转录和翻译，产生大量的TNF-α引起肾小管上皮细胞损伤。时间上，先出现p38大量活化，随后TNF-α的大量产生和肾组织的损伤，本实验也证实了这种推断，因此可以认为p38MAPK的活化在烧伤早期诱发肾脏组织损伤过程中起到非常重要的作用。烫伤组的血清Cr仅在伤后1、3 h有轻度升高，川芎嗪组也仅在伤后1 h有轻度升高，此可能与烫伤早期血容量的显著减少有关，另外也说明了肾脏强大的代偿功能。而川芎嗪治疗组肾组织p38的活化水平、肾组织TNF-α含量、以及电子显微镜下肾小管上皮细胞损伤程度都显著低于或轻于烫伤组，因此可以说川芎嗪对严重烧伤早期肾脏的保护作用可能是通过下调p38表达，减少TNF-α的产生来实现的。

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