不同海拔高原地区严重烫伤延迟复苏大鼠肺组织细胞凋亡及基因调控机制

　　作者：樊军,刘毅　　作者单位：兰州军区兰州总医院烧伤整形科,甘肃 兰州 730050

　　【摘要】目的：探讨不同海拔的高原地区严重烫伤延迟复苏后肺组织细胞凋亡及其基因调控机制. 方法: 雄性Wistar大鼠240只,分别在1517 m和3848 m海拔高度随机分为延迟复苏组(DFR, n=50), 即时复苏组(IFR, n= 60) 和对照组(n=10), 建立总体表面积30%的Ⅲ度烫伤模型,分别于伤后1, 6, 12, 24, 72和168 h取材.采用组织病理学、组织芯片技术、原位末端标记(TUNEL)法、免疫组织化学染色与图象分析技术,观察肺组织病理学改变与细胞凋亡及Bcl2和HIF1α的表达. 结果: 随海拔的增加,肺泡壁明显增厚,毛细血管内皮肿胀,肺泡腔中出现水肿液且有炎性细胞浸润,DFR组较IFR组差异有统计学意义(P<0.05),肺泡上皮细胞凋亡逐渐增多,各海拔高度DFR组均较IFR组变化大(P<0.05). Bcl2与HIF1α的阳性表达均位于肺泡上皮细胞的细胞核或胞浆,其表达强度实验组高于对照组(P<0.05),随海拔梯度上升Bcl2表达增强,各海拔高度DFR组Bcl2表达强度高于IFR组(P<0.05).细胞凋亡与Bcl2和HIF1α表达强度的变化呈正相关(r=0.872,0.945,P<0.05). 结论: 高原地区严重烫伤延迟复苏大鼠肺组织细胞凋亡数量随海拔梯度升高而增加,Bcl2和HIF1α对细胞凋亡具有调节作用.

　　【关键词】 烧伤;复苏术;肺泡/细胞学;上皮细胞;TUNEL;HIF1α;组织芯片;免疫组化;高原

　　0引言

　　近年的研究表明,多种脏器在发生缺血再灌注损伤时会出现细胞凋亡[1-2],但对于高海拔地区严重烫伤延迟复苏后大鼠肺组织的细胞凋亡及其基因调控机制,尚无文献报道.本实验通过建立高海拔地区大鼠严重烫伤延迟复苏模型,应用组织芯片技术[3-4]、原位末端标记技术、免疫组织化学染色和图象分析技术, 研究高海拔地区严重烫伤延迟复苏大鼠肺组织细胞凋亡及其可能的调控机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料健康雄性Wistar大鼠240只(兰州军区兰州总医院动物实验科提供), 体质量(250±30) g, 致伤前1 wk, 置室温19～25℃. 实验前24 h用电推推去背部被毛,单笼饲养.实验前12 h禁食、水. 10 mg/L戊巴比妥钠(40 mg/kg) 腹腔注射麻醉,分别在中度高原(1517 m)和高原(3848 m)地区建立大鼠背部30%Ⅲ度烫伤模型(病理证实),致伤条件为90℃, 20 s. 每一海拔梯度随机分3组:即时复苏组(IFR, n=60), 即刻腹腔注射等渗盐水4 mL/kg; 延迟复苏组(DFR, n=50), 6 h后腹腔注射等渗盐水4 mL/kg; 正常对照组(n=10), 模拟烫伤, 不补液. 原位末端标记试剂盒: TUNEL (3% H2O2, 柠檬酸缓冲液, TBS, 封闭液生物素化抗体和地高辛抗体, DAB显色剂等)由武汉博士德生物工程有限公司提供. HIF1α:兔多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司), 工作浓度1∶100; Bcl2：鼠单克隆抗体(北京中杉生物工程有限公司)工作浓度1:100; SP试剂盒(北京中杉生物工程有限公司, 武汉博士德生物工程有限公司); 彩色病理图文分析系统(同济医科大学千屏影像工程公司); 组织芯片制作仪(朝阳恒泰科技发展有限责任公司).

　　1.2方法

　　1.2.1取材伤后1, 6, 12, 24, 72, 168 h, 每组取10只动物, 将大鼠处死, 迅速开胸, 于肺尖部切取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小组织, 10%甲醛固定, 置4℃冰箱. 对照组同上述方法.

　　1.2.2组织芯片的制备应用组织芯片制作技术制备42(6×7)点列阵的组织芯片, 即由实验组各时相点肺组织标本与相应海拔梯度对照组肺组织标本组成. 具体操作如下:①所有标本经中性福尔马林固定, 56～58℃ 熔点石蜡包埋, 3～4 μm切片, 经苏木素伊红染色, 复核病理诊断,并在切片上标记出典型的病变区域; ②用组织芯片制作仪的针孔芯针在无组织的空白蜡块上钻孔(直径1.8 mm); ③借助玻片上的标记找准蜡块上的相应部位, 用组织芯针采集组织芯; ④将组织芯转移到空白蜡块中相应的孔中, 如此反复将数百个组织芯整齐有序安插在空白的蜡块中, 就制成了组织芯片蜡块; ⑤空位Marker选用两个正常的肝脏组织,位于芯片的一角.

　　1.2.3病理学观察将不同海拔高度实验组、对照组肺组织标本石蜡包埋、切片、HE染色，显微镜下观察照像.

　　1.2.4免疫组织化学分析采用SP法免疫组织化学染色, 按试剂盒操作说明进行, DAB显色, 苏木素复染. 对照组用PBS液代一抗. 免疫组化定量分析: 每张切片随机选5个高倍视野, 测每个视野阳性信号平均灰度值. 反应免疫组化染色越深, 灰度越小, 即阳性表达越高.

　　统计学分析: 采用SPSS10.0统计软件,计量资料用x±s表示;组间比较采用方差分析及LSDt检验;双变量相关分析采用Pearson相关分析,α=0.05.

　　2结果

　　2.1组织芯片整体观察42个点阵排列整齐, HE染色无掉片、重叠和扭曲现象, 适合免疫组化染色的观察和结果的判定.

　　2.2不同海拔高度肺组织细胞凋亡的变化与正常对照组比较IFR组与DFR组在各时相点表达均增强, 主要分布在肺泡上皮细胞的胞核. 定量分析示: ①DFR组与IFR组在两个高度各时相点均高于对照组(P<0.05); ②同一海拔高度, DFR组在6, 12, 24 h时相点, 其阳性表达强度均高于相对应的IFR组时相点(P<0.05); ③高海拔DFR组与IFR组的表达强度, 在6, 12, 24 h时相点, 强于低海拔DFR组与IFR组(P<0.05).

　　2.3不同海拔高度肺组织Bcl2的变化与正常对照组比较, IFR组与DFR组在各时相点表达均增强, 主要分布在肺泡上皮细胞的胞浆. 定量分析示: ①DFR组与IFR组在两个高度各时相点均高于对照组(P<0.05); ②海拔1517 m DFR组与IFR组相比, DFR组在6, 12, 24, 72 h时相点, 其Bcl2表达强度均高于IFR组(P<0.05); 海拔3848 m DFR组与IFR组相比, DFR组6 h阳性表达最明显, IFR组于24 h表达最明显; ③高海拔DFR组与IFR组的表达强度在6, 12, 24, 72 h时相点, 强于低海拔DFR组与IFR组(P<0.05).

　　2.4不同海拔高度肺组织HIF1α的变化正常对照组比较IFR组与DFR组在各时相点表达均增强, 主要分布在肺泡上皮细胞的胞核或胞浆. 定量分析示: ①DFR组和IFR组在两个高度各时相点均高于对照组(P<0.05); ②同一海拔高度DFR组与IFR组相比, 前者在6, 12, 24, 72 h时相点, 其HIF1α表达强度均高于相对应的IFR组时相点(P<0.05);③高海拔DFR组与IFR组的表达强度分别与低海拔DFR组与IFR组相比, 在6, 12, 24, 72 h时相点, 高海拔DFR组强于低海拔DFR组(P<0.05).两个海拔烫伤后大鼠肺脏组织TUNEL标记细胞凋亡免疫组化灰度值的比较  两个海拔烫伤后大鼠肺脏组织Bcl2免疫组化灰度值的比较  两个海拔烫伤后大鼠肺脏组织HIF1α免疫组化灰度值的比较

　　2.5相关性分析细胞凋亡与Bcl2间呈正相关(r=0.872, P<0.05);细胞凋亡与HIF1α间呈正相关(r=0.945, P<0.05).

　　3讨论

　　Bcl2是重要的抗细胞凋亡基因, 在严重烫伤延迟复苏后肺损伤中表现得尤为突出, 本实验显示在海拔1517 m, 伤后12 h在DFR组肺泡上皮细胞即出现凋亡细胞, 与此同时, 相应位Bcl2呈高度表达, 表明肺脏组织在严重烧伤延迟复苏后的肺泡上皮细胞可能是通过Bcl2的过度表达来发挥其抗凋亡作用, 减轻细胞损伤. Bcl2抗细胞凋亡的作用机制可能与以下几方面有关: ①抑制Ca2+的释放; ②bc12 通过阻止促进细胞凋亡基因信号传递或阻止这些诱导基因产物发挥作用; ③细胞内抗氧化作用. 也有研究表明, Bcl2抗氧化作用是间接的, 即可能在于抑制超氧阴离子的产生而不是直接清除活性氧, 而bc12的这种抑制超氧阴离子的作用与其能抑制细胞色素C的释放有关. 而在海拔3848 m, 伤后24 h DFR组肺泡上皮细胞和中性粒细胞大量凋亡, 相应位Bcl2的表达却较弱, 表明高海拔地区缺氧及缺血再灌注损伤更易引起肺组织细胞的凋亡, 其机制为: ①缺氧条件下Bcl2家族表达发生变化; ②高海拔地区缺氧可通过降低Bcl2基因的表达来促进大鼠肺组织细胞凋亡的发生, 这与司少艳等采用DNA降解、TUNEL法染色标记和Bcl2mRNA点杂交检测大鼠在慢性缺氧时胸腺细胞的增殖能力, 结果表明慢性缺氧可通过降低Bcl2基因的表达来促进大鼠胸腺细胞凋亡的发生相一致[5]; ③Bcl2可抑制导致凋亡或坏死的活性氧形成, 还通过调节质子流出而阻断细胞凋亡; ④缺氧诱导的凋亡主要是被抗凋亡蛋白过表达来阻滞的, 并且是以剂量依赖性的方式作用.

　　HIF 1α是一种随细胞内氧浓度变化而调节基因表达的快速转录因子.我们实验表明在高海拔地区严重烧伤延迟复苏后, 缺血、缺氧诱导了HIF 1α的表达，提示HIF1α参与了不同海拔严重烧伤延迟复苏后肺损伤的过程, 促进了肺组织细胞的凋亡. 目前认为, HIF1α表达增强, 促进肺组织细胞凋亡的机制可能与低氧、缺血再灌注状态下细胞线粒体产生大量的活性氧,以及与缺血再灌注后产生的OH有关, 它们能够稳定HIF1α, 使HIF1α免于被迅速降解. 低海拔正常对照组HIF1α在肺泡上皮细胞不表达,是由于正常细胞在常氧环境中, HIF1α的半衰期极短, 产生之后迅速被泛素化, 继而由蛋白酶溶解[6].

　　综上所述, 不同海拔地区严重烫伤延迟复苏后可以引发肺组织细胞坏死和凋亡,其细胞凋亡的产生可能与Bcl2和HIF1α基因蛋白的过量表达有关.

　　【参考文献】

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　　[3] Moch H, Kononen T, Kallioniemi OP, et al. Tissue microarrays: what will they bring to molecular and anatomic pathology [J]? Adv Anat Pathol, 2001, 8(1): 14-20.

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　　[6] Hamrick SE, McQuillen PS, Jiang X, et al. A role for hypoxiainducible factor1 alpha in desferoxamine neuroprotection [J]. Neurosci Lett, 2005, 379(2):96-100.