烧伤后小鼠类固醇受体辅活化子的表达变化

作者:李军,粟永萍,王军平

【摘要】  　　目的 观察小鼠烧伤后早期类固醇受体辅活化子（SRC）蛋白表达的时相变化，初步探讨烧伤早期糖皮质激素抵抗的分子机制。方法 将30只健康C57/129雄性小鼠随机分为正常对照组与烧伤组，烧伤组给予背部TBSA 15%~20% Ⅲ°烧伤。分别于伤后1、6、12、24小时采用Western blot测定肝、脾组织SRC家族（SRC1、GRIP1、NCOA3）蛋白表达水平的变化。结果 烧伤组肝组织SRC1蛋白表达水平在烧伤后1小时即显著降低，6小时降至最低，以后逐渐恢复，至24小时与正常对照组相比无显著差异；正常脾组织SRC1蛋白表达水平较低，测定结果无统计学意义。烧伤组肝组织GRIP1、NCOA3蛋白表达水平在烧伤后显著升高，12小时达到高峰，24小时仍显著高于正常对照组；烧伤组脾组织GRIP1、NCOA3在烧伤后1小时显著升高，GRIP1在烧伤后6小时达到高峰，24小时与正常对照相比差异不显著；而NCOA3在烧伤后12小时达到高峰，24小时显著高于正常对照组。结论 小鼠烧伤后早期SRC1显著降低，GRIP1、NCOA3显著升高，烧伤后糖皮质激素抵抗的发生发展可能与SRC家族成员表达变化有关。

【关键词】  烧伤 类固醇受体辅活化子 糖皮质激素抵抗

　　Changes of expression  of steroid receptor coactivators in the burned mice

　　LI Jun,SU Yongping,WANG Junping,et al.

　　（State Key Lab of Trauma,Burn and Combined Injury，Institute of Combined Injury of PLA,Third Military Medical University,Chongqing  400038,China）

　　Abstract：  Objective  To observe the changes of expression of steroid receptor coactivators（SRC） during the early stage in the burned mice,and the mechanism of glucocorticoid resistance(GCR).Methods  Thirty C57/129 male mice were divided randomly into the control and the burn groups.After clipping of the hair,15%~20% thickness Ⅲ°burn injury was produced.At 1,6,12,24h after burn,the levels of hepatic and splenic steroid receptor coactivators(SRC1,GRIP1 and NCOA3) were detected by western blot.Results  The level of hepatic SRC1 was markedly downregulated 1h after injury,and reached the lowest point 6h after injury,and gradually returned to the normal level 24h after burn injury.The expression of splenic SRC1 of the control group was a little lower,which was not statistically significant.The hepatic GRIP1,NCOA3 in the burned mice was significantly elevated compared with that of the control group,and peaked 12h after injury.The splenic GRIP1,NCOA3 was markedly elevated 1h after injury,and GRIP1 was peaked  6h  after injury,and gradually returned to the normal level,but NCOA3 was peaked 12h after burn,and still obviously higher than that of the control group 24h after burn.Conclusion  The SRC1 was markedly downregulated,and the GRIP1,NCOA3 was markedly elevated during the early stage of burn injury,which indicates that the glucocorticoid resistance after burn injury may be associated with the changes of expression of steroid receptor coactivators.

　　Key words:burn injury;steroid receptor coactivators;glucocorticoid resistance

　　严重创伤后，由于损伤、疼痛、失血、休克、酸中毒等刺激，机体产生强烈的应激和炎症反应，引起明显的应激反应紊乱。前期的研究发现，严重创伤后的应激反应紊乱主要表现为糖皮质激素抵抗（glucocorticoid resistance，GCR）、核因子κB （NFκB）功能增强、炎性细胞因子的大量产生，三者相互影响，互为因果，形成级联式放大效应，引发全身炎症反应综合征（SIRS）［1-3］。核转录因子糖皮质激素受体（GR）、NFκB、活化蛋白1（AP1）的功能状况对炎性细胞因子的产生至关重要，而GR、NFκB、AP1的功能又受辅调节蛋白（辅活化子或辅阻遏子）的调控。类固醇受体辅活化子（SRC）家族与GR、NFκB、AP1存在广泛联系，但在严重创伤后应激反应紊乱发生发展中的作用尚不清楚。本文拟通过研究小鼠烧伤后早期SRC家族蛋白表达的时相变化，初步探讨严重创伤后GCR的分子机制。

　　材料与方法

　　1  主要仪器与试剂超速低温离心机（德国Heraeus公司）；分光光度仪（美国Beckman公司）；电泳仪、凝胶成像分析系统（美国Biorad公司）；组织蛋白提取液（美国Pierce公司）；山羊抗SRC1多克隆抗体、兔抗GRIP1多克隆抗体、小鼠抗NCOA3单克隆抗体、兔抗GAPDH多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；辣根酶标记兔抗山羊IgG（H+L）、辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）、浓缩型DAB试剂盒（北京中杉公司）。

　　2  动物分组及处理清洁级健康C57/129雄性小鼠，30只，体重20~25g，由第三军医大学复合伤研究所实验动物中心提供。均背部去毛，随机分为正常对照组和烧伤组。正常对照组6只，脱臼处死，取肝、脾组织；烧伤组24只，使用凝固汽油烧伤，面积约15%~20%，Ⅲ°，分别于烧伤后1、6、12、24小时各脱臼处死6只，取肝、脾组织。

　　3  实验方法取组织块100mg加入组织蛋白提取液1ml匀浆，冰上裂解30分钟，4℃ 12000g离心20分钟，取上清。采用Bradford法测定总蛋白浓度。灌制6％分离胶和3.9％积层胶，各取总蛋白50μg行SDSPAGE，电泳结束后电转印4小时至PVDF膜。PVDF膜封闭液（0.5%BSA、0.01M PBS）内封闭，4℃过夜。分别加入山羊抗SRC1多克隆抗体（1：200）、兔抗GRIP1多克隆抗体（1：200）、小鼠抗NCOA3单克隆抗体（1：800）、兔抗GAPDH多克隆抗体（1：1000），37℃孵育1小时，PBST（0.01M PBS、0.02%吐温）洗膜5分钟×3，再相应加入辣根酶标记兔抗山羊IgG（1：500）、辣根酶标记山羊抗兔IgG（1：500）、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（1：500），37℃孵育1小时，PBST洗膜5分钟×3，最后硫酸镍铵增强法（DAB显示试剂1ml、2.5% 硫酸镍铵）显色。结果通过凝胶成像分析系统扫描并分析各条带OD值×面积（Int×mm2），并通过计算与内参GAPDH的比值进行半定量分析。

　4  统计学处理数据用±s表示，用SPSS 10.0统计软件，采用单因素方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

　　结果

　　1  烧伤后肝组织SRC1、GRIP1、NCOA3的蛋白表达结果见表1。肝组织SRC1蛋白表达水平在烧伤后1小时即显著降低，6小时降到最低，12小时有所恢复，24小时与正常对照相比无显著差异；GRIP1蛋白表达水平在烧伤后各时相点显著升高，其中12小时达到高峰，24小时仍显著高于正常对照；烧伤后1小时肝组织NCOA3蛋白表达水平与正常对照相差不显著，6小时开始升高，12小时达到高峰，24小时仍显著高于正常对照组（图1）。

　　2  烧伤后脾组织SRC1、GRIP1、NCOA3的蛋白表达Western blot分析见图2，通过凝胶成像分析系统半定量分析见表1。正常脾组织SRC1蛋白表达水平较低，测定结果误差太大，无统计学意义；GRIP1在烧伤后1小时显著升高，其中6小时即达到高峰，至24小时与正常对照组相差不显著；NCOA3在烧伤后各时相点均显著升高，12小时达到高峰，24小时显著高于正常对照。
 
　　表1  烧伤后早期SRC家族蛋白表达的变化（略）

　　与正常对照组相比：*P﹤0.05，﹟P﹤0.01

　　图1  肝组织SRC1、GRIP1、NCOA3 Western blot分析（泳道1：正常对照；泳道2、3、4、5：烧伤后1、6、12、24小时）（略）

　　图2  脾组织SRC1、GRIP1、NCOA3 Western blot分析（泳道1：正常对照；泳道2、3、4、5：烧伤后1、6、12、24小时）（略）

　　讨论

　　糖皮质激素（GC）是应激时释放的主要应激激素，研究发现小鼠烧伤后，早期即可发生显著的GCR，主要表现为炎性细胞因子大量分泌，血清皮质酮水平明显升高，而GR在蛋白水平却明显降低［1］，具体机制还不清楚。SRC家族作为核受体和其它转录因子的转录辅活化子，由SRC1/NCoA1、SRC2/TIF2/GRIP1、SRC3/RAC3/ACTR/pCIP/AIB1/NCoA3组成，通过组蛋白乙酰化/甲基化和募集另外的辅因子，以配体依赖模式显著增强核受体依赖的转录［4］。研究发现，SRC家族可作用于或辅活化炎症转录因子，如GR、NFκB、AP1［5-7］。严重创伤后，这些炎症转录因子的功能变化与GCR的发生发展有关，但是否受到SRC家族的调控还不清楚。本实验以15%~20%Ⅲ°烧伤为创伤动物模型，发现肝组织SRC1蛋白表达水平在烧伤后早期（1小时）即显著降低，6小时降到最低。SRC1是GR普遍存在的辅活化子［5］，烧伤后肝组织SRC1表达降低，可能是GR功能受到抑制，引起GCR的原因之一。研究发现，SRC1也可特定地与转录因子AP1亚基cJun、cFos和NFκB p50结合，以剂量依赖的模式增强AP1、NFκB介导的反式激活并在核受体和AP1、NFκB间的相互抑制中脱阻抑［6，7］。SRC1表达降低尽管在一方面可降低AP1、NFκB的反式激活，但另一方面，在一定程度上也可增强炎症介质AP1、NFκB与GR间的相互抑制，从而导致GR功能降低。本研究所利用SRC1基因敲除小鼠发现，烧伤后早期SRC1-/-小鼠GR表达降低程度重于SRC1+/+小鼠，且核转位能力也较弱，这进一步证实烧伤后早期GCR的发生发展与SRC1表达降低有关。SRC1在正常脾组织表达量很低，表明烧伤后脾组织AP1、NFκB的活性并不受SRC1的影响，可能主要与GRIP1、NCOA3有关。NCOA3是NFκB的辅活化子，过度表达的NCOA3以剂量依赖的模式显著提高TNFa诱导的基础NFκB转录活性，在NFκB介导的免疫和炎症反应以及细胞存活中扮演重要的作用［8］。烧伤后早期，肝、脾组织NCOA3显著增加，并持续到24小时以后，可导致NFκB活性显著增加。NFκB是重要的炎症转录因子，其表达和活性的增加能降低GC的生物学效应，阻断GR的核转位［9］。另外，Webster等［10］认为致炎细胞因子诱导的NFκB可引起GRαmRNA、GRβmRNA不对称的增加，使GRβ占优势水平，从而导致GCR。我们同期的研究结果证实NCOA3-/-小鼠在烧伤后早期GR表达无显著下调，且核转位能力显著强于NCOA3+/+小鼠（待发表），表明烧伤后早期NCOA3表达增加可能是GR功能抑制、GCR发生的重要原因。GR与AP1、NFκB间的蛋白蛋白交互作用调控炎症反应的发生发展，竞争有限数量的SRC1、GRIP1、NCOA3等辅活化子可能是重要的机制之一。烧伤后肝、脾组织GRIP1显著升高，可干扰GR/NFκB、GR/AP1间的相互反式阻抑，影响GR对炎症反应的抑制功能。另外，由于SRC1、GRIP1、NCOA3辅活化子之间存在相互补偿效应，烧伤后早期GRIP1增加可能是一种代偿反应，在一定程度上可弥补NCOA3表达增加的相对不足，从而加强AP1、NFκB的活性，促进创伤后炎症反应的发生发展，导致GCR的发生。SRC家族成员在创伤后GCR发生发展中起着重要作用，但由于表达广泛，能互相部分补偿生物功能，因此具体的作用机制很复杂，需要进一步研究探讨。

【参考文献】
  　　［1］李军,史忠,粟永萍.烧伤后小鼠血清皮质醇及肝组织糖皮质激素受体的变化［J］.第三军医大学学报,2002,24（12）:1427-1429.

　　  ［2］王明海,太光平,张雅萍,等.重组腺病毒对烫伤大鼠肝组织核因子κB活性的调控［J］.中华烧伤杂志,2002,18（1）:42-44.

　　  ［3］王军平,粟永萍,赵景宏,等.TNFα和IL1对大鼠肝细胞糖皮质激素受体表达及功能的影响［J］.第三军医大学学报,2002,24（5）:585-587.

　　  ［4］Xu J,O'Malley BW.Molecular mechanisms and cellular biology of the steroid receptor coactivator(SRC) family in steroid receptor function［J］.Rev Endocr Metab Disord,2002,3（3）:185-192.

　　  ［5］Grenier J,Trousson A,Chauchereau A,et al.Selective recruitment of p160 coactivators on glucocorticoid-regulated promoters in Schwann cells［J］.Mol Endocrinol,2004,18（2）:2866-2879.

　　  ［6］Na SY,Lee SK,Han SJ,et al.Steroid receptor coactivator1 interacts with the p50 subunit and coactivates nuclear factor kappa Bmediated transactivations［J］.J Biol Chem,1998,273（18）:10831-10834.

　　  ［7］Lee SK,Kim JH,Lee JW.Steroid receptor coactivator1 coactivates activating protein1mediated transactivations through interaction with the cJun and cFos subunits［J］.J Biol Chem,1998,273（27）:16651-16654.

　    ［8］Werbajh S,Nojek I,Lanz R，et al.RAC3 is a NFB coactivator［J］.FEBS Lett,2000,485（24）:195-199.

　　  ［9］Adcock IM,Brown CR,Barnes PJ.Tumour necrosis factor α causes retention of activated glucocorticoid receptor within the cytoplasm of A549 cells［J］.Bio Chem Biophys Res Comm,1996,225（2）:545-550.

　　  ［10］Webster JC,Oakley RH,Jewell CM,et al.Proinflammatory cytokines regulate human glucocorticoid receptor gene expression and lead to the accumulation of the dominant negative beta isoform: a mechanism for the generation of glucocorticoid resistance［J］.Proc Natl Acad Sci USA,2001,98（12）:6865-6870.