周期性应力下大鼠髓核细胞中整合素的表达及其意义

 本研究旨在观察在周期性应力作用下,髓核细胞中整合素表达的变化及其在细胞代谢中的调控作用,现报道如下材料和方法1材料:4周龄、体质量100g左右的SD大鼠,雌雄不拘(南京医科大学动物实验中心),胎牛血清(杭州四季青公司),DMEM-F12培养基、胰酶,II型胶原酶(Gibco公司),Trizol(Invitrogen公司,美国),cDNA第1链合成试剂盒(Fermentas公司,加拿大),荧光实时定量聚合酶链反应(FQ-PCR)MasterMix(SYBRGreen)(TO}}OBO公司,日本),FQ-PCR仪(DA7600,中山达安公司),细胞培养箱(BB5060,德国Hereus公司),旋转式生物反应器(Celdvn.公司HFB40,美国),往复式压力加压器(泰兴实验仪器厂).
    2.FQ-PCR引物的设计:选择研究较多的整合素a1-11,(31-8亚基,以及fl型胶原(collagen2a1)和蛋自多糖(aggrecan),通过Pubmed检索基因序号,使用Primer5软件设计相应引物,具体序列见表1,由南京金斯瑞科技有限公司合成引物.
    3.细胞的分离和培养:断颈法处死大鼠,无菌条件下切取胸腰段脊柱,仔细剔除周围韧带和软组织,快刀从腹侧切开椎间盘,取出髓核细胞,37℃下1.5%II型胶原酶消化2h,200目滤网过滤,然后置于15%胎牛血清(FBS)的DMEM-F12培养基中,37℃,5%CO:培养箱中培养当细胞达到80%融合率时进行传代第2代细胞按1x105/L的密度接种于玻片上(25mmx25mm),当细胞到达80%融合率时开始实验.
    4.细胞分组和加压:将细胞玻片随机分成对照组和加压组,加压组放入往复式加压器和生物反应器构建的周期性应力场内,以200kPa,O.1Hz}`,一的周期性应力加压6h.对照组在无压力环境下培养相同时间.
    5.细胞RNA提取和逆转录:Trizol法分别提取对照组和加压组细胞总RNA,使用cDNA第1链合成试剂盒将总RNA逆转录为cDNA.
    6.FQ-PCR:FQ-PCRSYBR采用Green法检测11型胶原、蛋白多糖、整合素al一cxl1亚基、田一郎亚基在实验组和对照组细胞中的表达,内参为p-actin.反应体系20闪,退火温度60℃.结果使用2一△DCT法分析.
    7.统计学方法:应用SPSS13.0统计软件分析. 结果以均数土标准差(无土、)表示.实验组与对照组之间比较采用t检验.
    结果
    FQ-PCR的结果详见表2.对照组和加压组中II 型胶原、蛋白多糖的表达差异有统计学意义(<0.O5),加压组分别为对照组的5.04倍和4.52倍.整合素助,郎的表达在两组中差异无统计学意义(P> 0.O5).对照组和加压组中整合素α1,α9,β2,β6的表达差异有统讨一学意义(P<0.05)但在实验过程中,a9,日2,日6的CT值大于32,数据质量较差,不予采信因此加压组中整合素al较对照组明显增加,为对照组的1.71倍其余亚基的表达在加压组中均比对照组要减少(P<0.05).
    讨论
    本实验结果显示通过施加.一200kPa,0.1Hz白七周期性静水压,观察到加压组髓核细胞的11型胶原和蛋白多糖的基因表达均明显增加,分别为对照组的5.04倍和4.52倍,这说明在髓核细胞中,压力确实能通过特定的信号传导途径转化为化学信号,从而促进了细胞的代谢整合素由.和日亚基通过共价键构成,每个亚基都包括饱外域、跨膜域和胞内域3部分((34除外),是连接Ni}'E外基质和细胞骨架的重要桥梁5伙其胞外域通片公口fr`y:,补基质中的胶原、纤连蛋白、层粘连蛋自相结合而}2.内城一方面u1‘与.一肌动蛋白、张力蛋白等细胞骨架蛋结合最终作用于肌动蛋自,引起细胞形态的变化;另一方0也可直接与整合素连接蛋白激酶、局部}r附0z酶等细胞内信号分子结合,介导信号传导因此.}xF.合素介导的细胞信号传导过程十分复杂,二仁同业墓在下同的靶细胞中起的作用也各不相同而在应力环境下,有关髓核细胞中整合素的相关研究较少本研究结果表明,在.--200kPa,0.1Hz的周期性应力环境下,髓核细胞中整合素al亚基的基因表达明显增高,为对照组的1.71倍,其余亚基的表达增高不明显,甚至表达明显减少_因此,在髓核细胞中,整合素al亚基在压力一化学信号传导过程中起主导作用,这种调控能促进细胞外基质的合成,从而为进一步研究髓核细胞内压力一化学信号传导通路奠定了实验基础.
    参考文献
    Nong L,Yin G,Ren K. Periodic mechanical stress enhances rat chondrocyte area expansion and migration throughSrc-PLCgamma1ERK1/2 signaling[J].European Journal of Cell Biology,2010.705-711.
    张广程,范卫民,马益民. 不同频率周期性压力对组织工程软骨的影响[J].中华实验外科杂志,2007,(6):677-678.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2007.06.012.
    范卫民,蔡俊. 周期性压力对组织工程软骨的影响及其作用机制[J].中华实验外科杂志,2006,(8):977-979.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2006.08.028.
    Livak K J,Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta DeltaC(T[J].Methods:A Companion to Methods in Enzymology,2001.402-408.
    Hynes RO. The emergence of integrins:a personal and historical perspective[J].Matrix Biology,2004.333-340.
    李晋辉,母得志. 整合素及其信号传导通路[J].医学分子生物学杂志,2007,(3):279-282.doi:10.3870/j.issn.1672-8009.2007.03.022.