shRNA慢病毒转染串珠素对大鼠硬膜外瘢痕中成纤维细胞增殖能力的影响

　　串珠素是细胞外基质中硫酸肝素蛋白聚糖之，存在于血管基底膜、肝脏和软骨基质中，与其他基质成分紧密结合，并自行组成二聚体和大的聚合体。串珠素参与细胞增殖、脂蛋白摄取、细胞瓤附和细胞外基质组装有研究’3’表明，抑制串珠素可影响小鼠胚胎成纤维细胞的增殖能力，而目前国内外尚无关于申珠素对硬膜外癖痕中成纤维细胞增殖能力影响的报道。本研究旨在通过Western-blot,荧光定量聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)检测及曝哩蓝(methvlthiazolyldiphenyl-}etrazoliumbromide，MTT)法测定不同分组的大鼠硬膜外瘫痕成纤维细胞增殖过程中串珠素水平的变化，进而分析串珠素与硬膜外瘫痕成纤维细胞增殖的关系，为顶防术后瘫痕形成提供基因方法治疗的新思路。
　　材料与方法
　　一、主要材料与试剂
　　大鼠原代瘫痕成纤维细胞(自行培养)，DMEM/F12培养液(Gibco公司，美国)，体积百分比为10%胎牛血清(fetalbovineserum,FBS}(杭州四季青生物工程材料有限公司)，质量百分比为0.25%胰蛋白酶(Gibc。公司，美国)，磷酸盐缓冲液(phO5phatebuffersolution,PBS)(Gibc。公司，美国)，青链霉素(Gibcc)公司，美国)，荧光蛋白shRA},V慢病毒颗粒(GFl'controllentiviralparticle)、串珠素、hR\A慢病毒颗粒[perlecanshRNA(m)lentiviralparticles]、膘吟霉素、兔抗大鼠IgG多克隆抗体均购自美国SantaCruz公司，辣根酶标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)，TotalRNA提取试剂(RNAisoPlus),PrimeScriptRT-PCRKit(逆转录PCR试剂盒50次量)均由宝生物工程(大连)有限公司提供。
　　二、模型制作
　　雄性Wisla:大鼠30只，清洁级(由山东鲁抗生物制药有限公司提供)，以L3或L、为中心显露棘突，咬除L:或L;全锥板，显露硬膜囊后纱布压迫擦拭。用生理盐水冲洗创面3一4次，无菌纱布轻拭干净，逐层缝合切口。术后大鼠于相同条件下培养。
　　三、瘫痕成纤维细胞的提取与培养
　　于第4周30只大鼠均采用原手术人路，取适量硬膜外瘤痕组织块，置人体积百分比10%的中胜甲醛缓冲液中，术中注意无菌操作。于细胞超净台将癖痕组织块转移至一个小的无菌培养皿中，用含双抗的PBS漂洗2次，用无菌剪刀将组织反复剪成大小约1mm3小块，在培养瓶壁上预先涂以薄层FBS，将组织送人培养瓶中，摆好。轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝卜，向瓶内注人含10%FBS的1640培养液4mL。将培养瓶送人CO=培养箱内，在37℃、体积百分比为5%COz,95%空气、饱和湿度下孵育4h后将培养瓶轻轻翻转，让培养瓶浸泡组织块，继续孵育。7〔后第一次换液，以后每3d换液二用0.25%胰蛋自酶消化并传代3次后按要求分组。
　　四、瘫痕成纤维细胞的分组、基因转染和克隆筛选将原代癖痕成纤维细胞分为3组:未转染的成纤维细胞组(空白对照组)、GFP慢病毒颗粒转染组(GFP组)和串珠素shRNA慢病毒颗粒转染组(shRNA组)。
　　原代瘸痕成纤维细胞用含双抗的DMEM/F12墙养液及1%PBS的培养液培养，在37℃、5%COz,95%空气、饱和湿度条件下培养，2一3d换液一次，传代3--4次使细胞达到良好生长状态(图1)，转染第1天将瘫痕成纤维细胞接种至%孔板，转染第2天细胞融合度达到70%左右观察细胞生长状态，予细胞换液，吸去上层清液加人无双抗的DMEM/F12培养液。转染组(GFP组和shRNA组)各孔按感染复数(multiplicityofinfection,MOI)值为10向培养液中分别加入GFP慢病毒颗粒和串珠素*hRNA慢病毒颗粒稀释液10},L,司时向各个孔加人10N.,LPolybrene液，使其浓度最终达到8}.},L/mL,混匀后放人培养箱内继续培养。转染第3天将含有慢病毒的培养液换为DMEM/F12培养液继续培养。3d后换液1次。在DMEM/F12含10%FBS的培养液中加人1N.L/mL漂吟霉素，并将细胞传代至此新鲜培养液中，在37℃、5%rCO=,95%空气、饱和湿度条件下墙养，进行阳性克隆筛选经嚓吟霉素筛选，1周后对照组细胞全部死亡，转染全眼田胞部分死亡，2周后转染组细胞开始增殖，3周后收集缥吟霉素阳性的细胞进行扩大培养(图2)。
　　五、串珠素mRNA的表达
　　检测培养3组细胞，细胞贴壁95%后，吸去培养液，置于冰上，加人适量Ttizol试剂，加人0.2mL氯仿，剧烈摇动，加人等体积异丙醇逐步提取RN,}。将每组细胞提取的RNA设置3个样本，并逆转录合成〔'DNA，以大鼠阶actin作为内参，上游引物:5’一GC(}AGAAGATGACCCAGCTC-3'，下游引物:5’一CCAGTGGTACGGCCAGAGG-3';串珠素上游引物:5'-TGGTTCGGGCCACATTCT-3'，下游引物5’一CACTTCTAGGCTCACAGCACTGA-3',(3-w,tin和串珠素的扩增片段长度分别为103饰和65by。在一定条件下反应，反应完成后，由荧光定量PCR仪AppliedBiO5vstems7500Real-TimePCRSysten、自动采集信号，记录并分析数据。
　　六、串珠素蛋自质表达检测
　　采用Western-bolt方法检测，分别将3组80%密度的瘫痕成纤维细胞PBS洗3遍，按100mL样品加100p,L裂解液的比例分别处理3组细胞，提取细胞总蛋白40p,g.}样行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭。分别用一抗为l:500兔抗大鼠串珠素单克隆抗体，二抗为山羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记)于聚偏氟乙烯室温孵育2h,PBS洗涤3次。暗室内显色、曝光、洗片。
　　七、细胞增殖率检测
　　采用MTT检测法将大鼠硬膜外瘫痕成纤维细胞用0.25%胰蛋白酶消化，用含0.1%FBS培养液配成单个细胞悬液，以何孔1000一10000个细胞接种至24孔板，每孔体积200},L培养细胞3一Sd将接种的细胞分为空白对照组、GFP组及*hRl}A组，每组6孔、shRNA组和GFP组分别加人相应的慢病毒颗粒进行转染，转染后的1一96h3组同时进行M`I'T检测。侮孔加MTT溶液(5mg/mL用PBs配制，pH-7)20}L，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加人150闪二甲基亚飒，小心震荡，使结爵，物充分溶解。选择490nrn波长，在PCR检测仪上测定各孔吸光度(A)值并记录结果。
　　八、统计学处理
　　应用spss13.o统计学软件进行处理，吸光度(A>值以C士、表示，组间的整体比较采用单因素方差分析，组内两两比较用sNK-c}检验，P<0.O5认为差异有统计学意义结果一、串珠素mRNA的表达western-blot检测显示shRNA组串珠素表达较低，空白对照组与(FP组的串珠素表达均明显高于shRNA组(图3)。
　　二、串珠素蛋白质的表达
　　荧光定量PCR检测显示、hRNA组串珠素表达较低，空白对照组与GFP组中的串珠素表达均明显高于shRNA组(图4)。
　　三、MTT检测增殖率结果
　　在0.107eFBs的D}VIEM培养液培养下，Oh各组吸光度(A)值差异均无统计学意义(P>0.O5，表1).24一96hshRNA组吸光度(值低于空白对照组和GFP组，差异均有统计学意义(F'<0.O5，表1).而空白对照组和GFP组吸光度(川值差异无统计学意义(T'>0.O5，表1)讨论硬膜外瘫痕又称硬膜外纤维化(epiduralfibrO5is是指在硬膜外腔的手术涉及范围内形成的瘫痕或组织纤维化，每一例腰椎术后的患者都会发生。串珠素是细胞外基质(extraelelularmatrix,ECM)中硫酸素类蛋白聚糖之一，它参与细胞增殖、脂蛋白摄取、细胞薪附和ECM组装，在调节血管生物学行为和损伤中具有重要作用，串珠索主要来源于血管内皮细胞和肌细胞，它可以通过与不同的细胞因子相互作用而引起不同的结果，与血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、人类生长因子等因子相互作用刺激血管内皮细胞的增殖和迁移{5)。
　　已有一研究，{将慢病毒载体应用于肿瘤、神经、血液等疾病在基因治疗的研究中，由慢病毒导人的目的基因可以在宿主细胞中长期而稳定的表达，本研究应用慢病毒介导的RNA干扰，通过载人组织特异性启动子而进行组织细胞特异性的RVA于扰，使串珠素的RNA表达发生改变导致串珠素与各种因子的相互作用发生变化，进而影响硬膜外瘫痕成纤维细胞的增殖能力，这为应用基因治疗方法抑制硬膜外瘫痕形成提供理论依据_本研究通过串珠素}hR\_1慢病毒转染，从而了解其对大鼠硬膜外瘫痕成纤维细胞的影响，结果显示通过慢病毒转染的成纤维细胞串珠素mR\A、蛋白质表达量明显降低成纤维细胞的增殖率亦降低，提示通过串珠素慢病毒转染叮抑制串珠素在硬膜外瘫痕成纤维细胞的表达，可改变其在成纤维细胞生成过程中与各种因子的相互作用，从而降低成纤维细胞的增殖能力瘫痕的形成过程涉及很多方面，如新生血管的形成、炎性反应细胞的浸润、组织细胞向成纤维细胞的转化和成纤维细胞的增生等，这些过程中涉及很多因子的作用，串珠素在硬膜外瘫痕形成过程中的表达与作用国内外目前没有相关报道，本研究初步探讨了抑制串珠索对硬膜外瘫痕成纤维细胞增殖能力的影响，但串珠索与生长因子的相互关系和具体作用机制并未深人探讨，有待于进一步研究。
　　参考文献
　　Zoeller J J,Whitelock JM,Iozzo RV. Perlecan regulates developmental angiogenesis by modulating the VEGF-VEGFR2 axis[J].Matrix Biology,2009.284-291.
　　Jiang X,Couchman JR. Perlecan and tummor angiogenesis[J].Journal of Histochemistry and Cytochemistry,2003.1393-1410.
　　徐明,褚言琛,邹云雯. 串珠素shRNA慢病毒颗粒转染对小鼠胚胎成纤维细胞增殖能力的影响[J].中华创伤骨科杂志,2012,(3):236-240.doi:10.3760/cma.j.issn.1671-7600.2012.03.013.
　　Segev A,Nili N,Strauss BH. The role of perlaecan in aterial injury and angiogenesis[J].Cardiovasc Rse,2004.603-610.
　　Casar JC,Cabello-Verrugio C,Olguin H. Hepara sulfate proteoglycans are increased during skeletal muscle regeneration:requirement of syndecan-3 for successful fiber formation[J].Journal of Cell Science,2004,(pt 1):73-84.
　　Yu D,Jia WW,Gleave ME. Prostate-tumor targeting of gene expressing by lentiviral vectors containing element of probasin promoter[J].Prostate,2004.370-382.
　　孙亚男,刘鸣,田霖丽. MMP-9小干扰RNA重组慢病毒抑制喉癌体内生长的实验研究[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2008,(24):1129-1131.doi:10.3969/j.issn.1001-1781.2008.24.010.
　　Poeschla E,Corbeau P,Wong-Staal F. Development of HIV vectors for anti-HIV gene therapy[J].Proceedings of the National Academy of Sciences(USA),1996.11395-11399.