牵张应力环境下六味地黄汤含药血清对成骨细胞增殖分化影响的实验研究

　　成骨细胞是骨组织中机械应力的主要效应细胞，研究力学刺激对成骨细胞的作用可为探讨体内骨骼力学应答现象提供实验依据。中医理论认为，“肾藏精，主骨生髓”，即补肾中药对骨骼的生长发育、强壮衰老有重要作用。六味地黄汤是补肾的基本方，作用重在滋阴补肾、强筋壮骨，在骨科应用较广，临床疗效显著。研究发现，六味地黄丸能有效抑制细胞色素C的释放，减缓软骨细胞凋亡1，不仅是治疗肝肾不足、湿热痹阻型强直性脊柱炎安全而有效的方法;而且能有效提高原发性疏松症患者的骨密度，尤其是腰椎的骨密度。本实验拟观察牵张应力环境下，六味地黄汤含药血清对成骨细胞增殖活性的影响，为探讨机械应力诱导骨生长的力学细胞生物学机制提供实验依据，并对六味地黄汤促进成骨细胞增殖活性的作用进行初步研究。
　　1材料与方法
　　1.1材料一与实验动物
　　1.1.1主要仪器二氧化碳恒温培养箱(德国Thertn<)电子公司)，双人单面超净工作台(苏州净化设备有限公司)，倒置显微镜及显微拍摄系统(德国Leica公司)，台式自动平衡离心机(北京医用离心机厂)，BioTek800酶标仪(美国BioTek公司)，电子大平(德国Sartorious公司)，细胞牵拉装置FlexcellFX-4000T(美国FlexercellInternationalCorp.公司)。
　　1.1.2主要试剂与材料l0%水合氯醛(浙江省中医院制备)，RPMI1640培养基(美国Gibc。公司)，胎牛血清(杭州四季青生物公司)，0.25%胰蛋白酶(吉诺生物医药技术有限公司)，I型胶原酶(达文生物有限公司),MTT试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)，碱性磷酸酶活性测定试剂盒(南京建成生物公司)，碱性磷酸酶试剂盒(南京建成生物公司),PBS缓释液(占诺生物医药技术有限公司),96孔平板细胞培养板(美国Corning公司)，I'lexcell专用六孔培养板(美国FlexercellInternationalCorp.公司)1.1.3实验动物SD大鼠30只，雄性，清洁级，体重(200士20)g，由浙江中医药大学动物实验中心提供，用于制备含药血清新生SD大鼠乳鼠6只，雄性，清洁级，由浙江中医药大学动物实验中心提供，用于成骨细胞培养。
　　1.2血清制备
　　1.2.1药物选取六味地黄汤成药(山浙江中医药大学药物制剂室提供，主要成分为熟地黄、山茱英、山药、泽泻、丹皮、获菩等)。
　　1.2.2含药与空白血清的制备取健康雄性SD大鼠30只，随机分为六味地黄汤组和空白对照组，每组15只。给药剂量均按人日用临床剂景，经“人-大鼠体表面积比值”折算成相当于人的临床剂量给药，以每100g大鼠灌胃1ml(含生药量2g)计算给药浓度，空自对照组给子等量生理盐水二连续给药1周，末次给药后2h，采取10%水合氯醛腹腔注射麻醉，心脏取血。所取血液4℃保存2b后，3000r/min离心10min，取上层血清;560C30min水溶灭活，同组血清混匀，并经0.45}.A,m和0.22N.,m(光面朝上)滤膜抽滤除菌，每瓶4ml分装，于一20℃条件保存备用。
　　1.3成骨细胞培养传代、鉴定及分组
　　1.3.1成骨细胞体外培养传代取新生24h,SD大鼠乳鼠6只，颈椎脱臼处死后，以75%乙醇浸泡10min取出。揭去头顶皮肤，切下头盖骨置于PBS液内，清除骨膜、血管等结缔组织，用PBS液清洗2次后，将清洗至发自的头盖骨剪成1mmxlmm小片、〕将骨片移人5m1,0.25%胰蛋白酶溶液内，37℃下预消化20min，以清除纤维组织。将骨片移人另一含5ml.0.1%I型胶原酶溶液中，37℃振荡消化分离细胞60min，收集消化液。将收集的消化液在1000r/min下离心10min，吸去上清液，沉淀的细胞团块用培养液制成细胞悬液;剩余骨片重复用I型胶原酶震荡消化、离心，制成细胞悬液。将2次细胞悬液混匀、计数，移人培养板、培养瓶，置于370C,5%COZ培养箱中培养。24h左右换液1次，以后每2}3d换液1次，至细胞长成融合状态进行细胞常规传代。
　　1.3.2成骨细胞的鉴别
　　(1)细胞形态学观察〔培养24h细胞贴壁后，可将2组盛有成骨细胞的培养瓶置于倒置荧光显微镜下进行观察、拍照。
　　(2)碱性磷酸酶染色。用碱性磷酸酶试剂盒采用重氮盐法(改良Kaplow氏法)行碱性磷酸酶染色。步骤如下:①固定。抽吸24孔培养板中1孔或多孔的培养液，用PBS缓冲剂清洗2次，待干燥后，滴加固定液固定3min,②加底物应用液。固定样本后，滴加底物运用液，将培养板放人湿盒(含双蒸水纱布的容器)避光37℃孵育巧min,用双蒸水水洗。③复染。趁湿用复染液复染(苏木素或甲基绿)3min左右，水洗，显微镜下观察。
　　1.3.3细胞分组将细胞分6组，分别为:生理盐水血清对照组，六味地黄汤含药血清对照组，生理盐水血清6%牵张形变组，六味地黄汤含药血清6%牵张形变组，生理盐水血清l2%牵张形变组，六味地黄汤含药血_清12%牵张形变组。每组12孔(分别用于12,24h检测)，接种每毫升1x105个第3代细胞混悬液2m上。
　　1.4干预措施
　　1.4.1血清十预接种好的细胞，采取无血清培养基同步化培养24h。细胞贴壁后，生理盐水血清对照组、生理盐水血清6%牵张形变组、生理盐水血清12%牵张形变组分别加人等量巧%的空白血清培养基;六味地黄汤含药血清对照组、六味地黄汤含药血清6%牵张形变组、六味地黄汤含药血清12%牵张形变组分别加人等量巧%的六味地黄汤含药血清培养基。置于370C,5%CO:培养箱中培养24h。
　　1.4.2成骨细胞力学加载对相应组}!l施加应力，具体方法如下:生理盐水血清对照组、六味地黄汤含药血清对照组不施加牵张应力，常规培养;生理盐水血清6%牵张形变组、六味地黄汤含药血清6%牵张形变组，在采用0.5Hz频率、6%的形变量牵张应力条件下，常规培养;生理盐水血清12%牵张形变组、六味地黄汤含药血清12%牵张形变组在采用0.5Hz频率、12%的形变量牵张应力条件下，常规培养)。
　　1.5观察指标与方法。
　　1.5.1碱性磷酸酶(ALP)定量测定各组细胞分别于12,24h后取6孔上清液，按试剂盒操作说明在酶标板上分测定孔、标准孔、空白孔，测定孔加人各组细胞上清液，每孔30闪，标准孔加入浓度为0.02mg/ml酚标准应用液30闪，空白孔加入双蒸水30闪。每孔继续加人缓冲液50闪，基质液50闪，充分混匀后，将酶标板置于37℃水浴15min，各孔加人显色剂150闪，轻轻振摇孔板均匀，在波长520nm下，酶标仪测定各孔吸光度。测定后计算碱性磷酸酶含景。公式如下:ALP(金氏单位卜(测定孔吸光度一空白孔吸光度)/(标准孔吸光度一空自孔吸光度)x酚标准品浓度(0.02mg/ml)x100mlx样品测定前稀释倍数单位定义:100ml的液体在37℃与基质作用巧min产生1mg酚为1个金氏单位。
　　1.5.2成骨细胞增殖测定(MTT法)各组细胞分别于1乙24h后取6孔，弃细胞上清液，换为无血清细胞培养液，每孔2ml，同时一加人质量浓度为5g/L的MTT溶液，每孔200闪,37℃继续孵育4h后终止培养，小心吸弃孔内的培养液。每孔加人2mlMTT溶解剂，振荡10min。将每孔溶液以100闪分组加人96孔培养板中，于570nm波长处测定吸光度值(OD)，比较各孔OD值大小1.6统计学处理采用SPSS17.0软件进行统计分析，计景资料以均数士标准差表示，多样本均数的两两比较采用单因素方差分析(One-wavA1_VOVA)，方差齐性采用LSD法，方差不齐采用Dunnett'sT3法。以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1成骨细胞鉴定结果
　　2.1.1细胞形态学鉴别培养24h后，细胞多呈梭形、三角形或有2--3个突起，胞质透亮、饱满(图1),符合成骨细胞形态学特征。
　　2.1.2碱性磷酸酶(ALP)染色结果重氮盐法(改良Kaplow氏法)碱性磷酸酶染色显示，细胞胞浆内含c;AKP颗粒(见图2),ALP阳性。
　　2.2成骨细胞增殖分化能力检测结果
　　2.2.1 12h成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性及细胞增殖活性(MTT)检测结果生理盐水血清对照组与含药l}l_清对照组培养12h，成骨细胞ALP和MTT检测结果差异均无统计学意义;各加力组(盐水6}}0形变组、含药60}c形变组、盐水12%形变组、含药12%形变组)在加力频率为0.5H:条件下，分别加载6%和12%的牵张应力12h，各组成骨细胞ALP和MTT检测结果差异均无统计学意义(见表1)。
　　2.2.2 24h成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性及细胞增殖活性(MTT)检测结果盐水血清对照组与含药血清对照组培养24h，成肾细胞AL.P和MTT检测结果差异均无统计学意义;各加力组(盐水6%形变组、含药6%形变组、盐水12%形变组、含药12%形变组)在加力频率为0.5Hz条件下，分别加载6%和12%的牵张应力24h，各组成骨细胞的ALP和MTT检测结果的差异有统计学意义，24h含药6%形变组和24h含药12%形变组的ALP及MTT值均大于24h含药血清对照组，且24h含药12%形变组的ALP及MTT值大于24h含药6%形变组(见表1)。
　　3讨论
　　3.1力学刺激对一成骨细胞的作用在生理状态下，骨组织为适应机体活动所需的物理支持而在不断地改建和塑形，以满足不同个体对动作或姿势的特殊需求，即使在骨髓闭合后，如长期暴露于某一特定的力学环境，仍可出现骨骼的重塑形，使负重部位A量增多。同样，当骨组织长期失去正常的力学刺激，己矿化的骨骼也可出现明显的脱钙、疏松，临床上长期卧床或制动都可导致相应的部位出现骨质疏松研究表明，机械力刺激是骨折修复、正畸牙移动、牵张成骨以及骨压缩等骨组织改建中骨形成和改建的关键因素X41成骨细胞在适当应力刺激下可加快增殖和分化，分泌骨基质，促进骨形成根据细胞的来源、环境，如激素水平，施加的力的大小、性质的不同和供体的年龄不同，细胞刘一力学刺激的反应亦不同。
　　SOTI等发现流体剪切力与基质蛋白的表达有密切关系，成骨细胞受流体剪切力刺激后，可明显增加骨桥蛋白和碱性磷酸酶的表达，同时I型胶原、核心蛋白多糖分泌也明显增多。李菲菲等[L}l研究发现成骨细胞在机械牵张应力作用下蛋白表达发生显著变化，这些差异蛋白参与了成骨细胞力学反应机制的不同过程。本实验通过Flexercell公司生产的细胞加载系统分别对体外培养的大鼠成骨样细胞和六味地黄汤含药而清培养的大鼠成骨样细胞施加一系列不同大小的牵张应力，观察成骨细胞的增殖活性方面的改变，从药物与力学结合角度来阐述成骨细胞受力学刺激后的一系列变化，为骨质疏松等一系列的骨系疾病提供一个新的治疗思路。
　　3.2六味地黄汤对成骨细胞的作用中医药治疗骨质疏松有良好效果，六味地黄汤作为补肾基本方而应用于骨科临床。本实验将中药六味地黄汤作用于成骨细胞，观察细胞的增殖与分化，从另一个侧面反映中药对骨质疏松的作用。本实验六味地黄汤含药血清对成骨细胞无明显作用，可能与含药血清和细胞作用时间过短有关。
　　3.3牵张应力对成骨增殖和分化的影响本实验在牵张应力环境下用中药六味地黄汤含药血清作用于成骨细胞，将第3代成骨细胞按一般传代方法接种至Flexcell专用六孔培养板上，接种后先用不含血清培养基进行饥饿培养，使细胞同步化后牵拉。经过MTT检测法发现牵拉12h，各组之间无显著差异。牵拉24h后，6%和12%的形变量对成骨细胞具有促进增殖作用，且12%的形变量比6%形变量促细胞增殖作用更明显。通过观察和测定，证实牵张应力可以明显促进体外培养SD大鼠成骨细胞的增殖，且随着刺激时间的延长，形变量的增大，对成骨促增殖作用更加明显。
　　碱性磷酸酶(ALP是主要分布于细胞膜的钙结合转运蛋白，促进细胞成熟、钙化伙ALP活性增强时，骨形成增强，并促进骨基质矿化形成，故ALP的活性是反映成骨细胞分化程度和功能状态的良好指标本实验结果表明牵张应力能够促进成骨细胞分泌:}LP,增强ALP活性，促进成骨细胞的分化，增强成骨细胞骨基质的形成。应变下ALP的活性，不同文献有不同报道，胡静等H利用细胞拉伸加载装置对细胞施加12%的应变，发现在施加张应力作用后6,12,24h均增高，加载时间越长，增加越明显唐丽灵等发现500微应变下，成骨细胞加载24h，拉伸刺激提高r成骨细胞ALP的活力，而在1000微应变加载24h，拉伸则使成骨细胞的ALP活力降低。
　　而本实验随着拉伸时间延长，形变量加大，细胞产生ALP增多。
　　总之，本实验用牵张应力和含药血清结合作用于成骨细胞，但是在具体操作上还有许多不足之处，虽然模拟了应力作用下体内环境产生的药理效应，但是毕竟体内细胞承受的应力环境较为复杂，单纯的体外实验尚无法替代体内的真实情况，且药物的给药剂量、制备方法、产生效应的时间等尚缺乏相关研究。因此，在今后的研究中，需要进一步探索力学与药物环境下成骨细胞的变化，使两者更好结合，以利于推动力学生物学的发展。
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