金刚健骨片调节整合素β1和αvβ3表达水平的实验研究

　　近年来研究发现成骨细胞、破骨细胞表面均有整合素的表达，目_与骨形成及骨吸收的调控有关，整合素与骨质疏松症的关系已成为目前的研究热点。本实验选取成骨、破骨自i1胞各自的代表受体αvβ3进行观察。“肾虚髓亏”是绝经后骨质疏松发病的中医病理本质，补肾法是中医药治疗骨质疏松症的核心治法。故本研究选用了补肾法的代表方金刚健骨片，该力一为我院的经验方，临床疗效满意。
　　在此基础上进行实验研究，并从成骨一破骨细胞偶联及整合素表达水平的角度出发，力求从更深层次揭示金刚健骨片治疗骨质疏松的机制。
　　1材料与方法
　　1.1实验动物10月龄清洁级Wistar雌性大鼠，体质量X350士20)g，共50只，由湖南中医药大学实验动物中心提供。
　　1.2实验药物及试剂金刚健骨片:由补骨脂、熟地黄、川牛膝、鹿角胶、冤丝子、肉从蓉、杜仲、粉草、山药等9味中药组成，湖南中医药大学第一附属医院药剂科生产成片剂，(院)卫生剂08-043号，每片0.3g，成人剂量每次1.5g,每日3次。骨松宝颗粒:主要由淫羊霍、生地黄、牡砺等9味中药制成，贵州富华药业有限责任公司生产，黔卫药准字(1996)第山西亚宝药业(集团)100079号，成人齐d量每次10g,每日3次。福善美:由默沙东中国有限公司生产，每片10.0mg，成人剂量为每次1片，每日1次。抗Itg日l单克隆抗体(Pharmingen公司产品)，链亲和素一AB复合物(Sigma公司产品)。
　　1.3动物模型的建立2%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉，常规手术消毒，俯卧位固定，约在肋下1.5cm、脊柱旁开1cm处做长约2cm的纵向切口，完整摘除双侧卵巢。彻底止血后，分2层依次缝合肌肉、皮肤假手术组(SHAM)以同样切口切除左右两侧肠系膜各1段，其重量与卵巢重量相同。术后J常规肌注青霉素，连续3d。所有动物在相同条件、环境下分笼饲养13周。
　　1.4动物分组与治疗采用完全随机法将去势大鼠分为5组:福善美组(FSM)、金刚健骨片组(JCJG)、骨松宝颗粒组(GSB)、模型组(OVX)和假手术组(SHAM)。从去势术后第14周起开始对5组大鼠分别以不同药物连续灌胃13周，模型组及假手术组的药物以生理盐水替代:根据《药理实验方法学》(第3版)进行人与动物剂量换算，灌胃剂量分别为:金刚健骨片(每只大鼠每I}0.13g);骨松宝颗粒(每只大鼠每日0.86g);福善美(每只大鼠何日0.28mg)所有大鼠每周测量体重1次，并按体重变化调整给药量。
　　1.5检测指标与方法
　　1.5.1骨密度测定将大鼠颈椎脱臼处死后，取下大鼠右侧股骨，剔净附着的软组织，用双能X线骨密度测定仪(DXA)测定股骨的骨矿密度。测量时选用小动物模式进行扫描，设定速度为60mm/s，分辨率为1.0mmx1.0mm1.5.2整合素。v(33及日l测定取L，椎体于4%多聚甲醛中固定12h，脱钙脱水，石蜡包埋，切成5}.,m厚薄片，于体积分数为3%过氧化氢中浸泡25min，以阻断内源性过氧化物酶活性。自来水冲，蒸馏水洗;10g/L胰蛋白酶溶液(pH7.2)抗原修复，370C,10min0蒸馏水洗，PBS5min2次;滴加生物素标记的抗Itgayr(33(或Itg(3,)单克隆抗体(Pharmingen公司产品)，抗体稀释度1:50,370C孵箱35min,PBS5min2次;滴加链亲和素一AB复合物(Sigma公司产品)，稀释度1:200,370C,40min,PBS5min2次;DAB显色，适时终止;苏木素复染，加拿大胶封片。
　　阴性对照片不加一抗，改加1mol/LPBS缓冲液，其余操作步骤不变。
　　1.6统计学处理数据均采用SPSS16.0统计软件进行统计分析，所得数据定量资料均采用均数士标准差表示，多组间比较方差齐时用单因索方差分析，两两比较时用t检验，方一差不齐时用秩和检验;计数资料采用丫检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1骨密度测定假乎术组骨密度为(0.243士0.006),3个治疗组和模型组骨密度结果见表1}3个治疗组的骨密度均高于模型组，其中福善美组与金刚健骨片组骨密度均高于骨松宝颗粒组，而福善美组与金刚健骨片组骨密度差异无统计学意义(p>0.05)。
　　2.2整合素表达结果见图1-2。将切片于高倍镜视野(x200)下观察并摄片，整合素日l的阳性表达信号为棕黄色团块，骨基质中的表达较弱，该受体在成骨细胞中的表达较为明显。观察结果显示:假手术组(图la)可见大量棕褐色团块，表达最为显著;金刚健骨片组(图1b)可见棕黄色团块，但密度不及假手术组;福善美组(图lc)、骨松宝颗粒组(图1<I)可见少量淡黄色团块;模型组(图1e)整体呈现蓝紫色改变。整合素a}-(3:的阳性表达的信号亦为棕黄色团块，假手术组(图2a)基本呈现蓝紫色;金刚健骨片组(图2b)、福善美组(图2c)可见少量棕黄色团块;骨松宝颗粒组(图2a)亦可见棕色表达，但密度不及模型组;模型组(图2e)骨组织呈棕黄色。
　　运用图像分析软件Image-ProPlus5.0计算每个视野下阳性表达的平均光密度值。平均光密度值=阳性表达的积分光密度值/视野总面积(不计空白)，假手术组整合素日，平均光密度值为0.088士0.005,整合素。、日:平均光密度值为0.007士0.003,3个治疗组和模型组整合素日1和整合索a};(3:平均光密度值结果见表1。由表1可见，3个治疗组的整合素日;水平均高于模型组，其中金刚健骨片组高于福善关组及骨松宝颗粒组;福善美组及骨松宝颗粒组差异无统计学意义(P>0.05)}3个治疗组整合索。、日s的表达水平低于模型组，其中福善美组及金刚健骨片组均低于骨松宝颗粒组，而两者差异无统计学意义，福善关组与假手术组比较差异亦无统计学意义(P>0.05)o3讨论骨质疏松症在祖国医学中属于“n,I7屡”范畴。补肾法是中医药治疗骨质疏松症的核心治法，补肾中药对于骨质疏松症治疗效果已被大量的实验研究和临床应用证实金刚健骨片用十老年或妇女绝经后骨质疏松症方一中熟地黄、鹿角胶为君药，有补肾生髓之功;研究表明熟地黄可促进体内钙沉积，提高患者骨密度3;鹿角胶可增加去势大鼠成骨细胞数，同时减少破骨细胞认补骨脂、肉从蓉、杜仲、免丝子为臣药，可补肾益精、强筋健骨;现在药理学研究证实5一补骨脂可促进骨形成，具有雌激素样作用;肉从蓉可诱导BMSCs向成骨细胞分化;杜仲总黄酮，丁通过促进成骨细胞增殖而具抗骨质疏松作用。全方配以川牛膝、粉草、山药祛风除痹，引药下行;于大永等，研究发现牛膝可抑制骨吸收。
　　近年来普遍认为s在骨重建过程中，成骨一破骨细胞的偶联是骨重建的核心。以往的研究由于条件的限制，无论是促性激素，成骨细胞、破A细胞活性，还是调节钙、微量元素及相关细胞因子，都很少从根本上涉及到成骨一破骨细胞偶联的关键问题，而要研究成骨一破骨细胞偶联问题，就必须涉及到整合素这一关键受体。整合素是破骨细胞上的一类跨膜蛋白，可引导生长因子激活信号通路，刺激成骨细胞表达和分泌()PC-，从而使OPG在破骨细胞分化环路中发挥重要的负调节作用。代表av}:整合素的玻璃勃连蛋白受体(VnR)在许多组织广泛表达，但仅在破骨细胞上特异性地高表达，表明。、日:整合素对破骨细胞的功能有重要影响io日:是成骨细胞所表达的整合索的最主要的受体，促进成骨细胞分化、成熟“。故木研究选取整合素日1及。V日:分别作为成骨、破骨细胞的代表进行观察。
　　本研究结果显示:①金刚健骨片具有一预防和治疗骨质疏松症的作用。②金刚健骨片能显著提高成骨细胞上的整合素}i的表达水平。③金刚健骨片可降低破骨细胞上的整合素a}(3:的阳性表达率。据此可以推测，金刚健骨片有可能是通过干预成骨一破骨细胞的偶联，从而完成骨重建而达到治疗目的。在今后的研究工作中，将进一步探索补肾中药对整合素受体的调控途径，明确其对相关的细胞信号通路的调控作用及各靶向蛋白的变化规律。
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