1株具有低营养抗逆特性的嗜麦芽寡养单胞菌的分离和鉴定

医院内病原微生物的广泛分布是导致院内感染的关键因素，而病原微生物不但给病人的康复带来巨大威胁，也给医用仪器的消毒维护和检测结果的可靠性造成一定的干扰。从医用检验和治疗仪器上分离并鉴定病原微生物，既可以优化仪器的维护方法，又将为院内微生物感染的防治奠定基础。流式细胞术(flow cytometry)具有操作简便、分析快速及结果客观、精确等优点，已成为实验室科学和临床检验医学应用与研究的热点之一。流式细胞仪的流动室直接接触临床样品(特别是血液样品)，检测后可能会有少量临床样品中携带的病原微生物残留于此，给流式细胞仪的日常消毒和维护带来巨大挑战。在对流式细胞仪进行消毒维护时，我室主要采用“强氧化剂一一次氯酸钠消毒液反复冲洗流式细胞仪的流动室及管路”的策略，这种策略通常可以清除所有残留于流式细胞仪管路中的微生物。然而，我室近来却从上述常规消毒维护的流式细胞仪流动室中分离得到了一株具有高抗逆(强氧化剂、极低营养环境)能力的种属未知的细菌，次氯酸钠等常规消毒策略均无法对其进行彻底灭杀。本研究将对这株未知微生物的种属及抗逆特性进行初步鉴定，为丰富抗逆微生物的资源和流式细胞仪的消毒维护奠定重要基础。

1材料与方法

1.1菌株实验所用菌株分离自流式细胞仪(FACS calibur,BD)的流动室，菌株编号为YL08 0 

1.2培养基与试剂I_B培养基:酵母提取物5.0 g/I，蛋白陈10.0 g/L,NaCl 10.0 g/L,pH 7.}I 0 PBS缓冲液:N aCl 8.5 g/工，Na;HPO4·12H20 3.5 g/L，NaH=P()·2H20 0.25 g/L,PH 7.60 Taq DNA聚合酶及dNTPs(Fermentas);蛋白酶K(Roche);引物合成(SANGON);}-Hind III digest和DL 2000标准核酸分子量0 1.3菌株形态鉴定将菌株YL08在工B培养基上3 5 0C培养2}-3 d后观察菌落形态。挑取菌体涂片，革兰氏染色后，用光学显微镜观察菌体特征。

1.4低营养抗逆特性收集LB培养基培养的YL08菌液，PBS缓冲液洗涤，去除营养培养基后储存于PBS缓冲液中，350C 100 r/min振荡培养;每间隔7d从PBS菌液中挑取适量菌液，LB固体培养基上划线，3}℃恒温培养，通过观察菌体能否复苏判定其在无营养条件下的抗逆生存能力。

1.5分子生物学鉴定

1.5.1基因组DNA的提取采用CTAB法提取YL08基因组DNA。取2g菌体，液氮研磨至白色粉末状，转人50司无菌离心管中，加人5.0 ml CTAB抽提缓冲液(2 0 o CTAB,100 mmol/I_Tris-HCl，20 mmol/I_EDTA，1.4 mmo叭、NaC1,2 0 o尽一琉基乙醇，0.1 mg/ml蛋白酶K)和1/10体积的10 0 0 SDS，振荡混匀;65℃水浴30 min;冷却至室温;40C,12 000 r/min，离心5 mm。取上清，加等体积酚/氯仿/异戊醇(25;24;1),4 0C 12 000 r/min离心5 min;取上清，加人等体积氯仿/异戊醇(24:1)，离心;加人两倍体积冰预冷无水乙醇,-20℃过夜，离心;70%乙醇洗涤沉淀2次，100川TE(PH 8.0)溶解，-20℃保存。

1.5.2 DNA定性及定量分析取2川制备的基因组DNA原液，用ND-1000型(Nano Drop)微量紫外分光光度计检测基因组DNA的浓度以及OD2s。值，每样重复3次。取2川样品进行0.800琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统(Bio Rad)进行DNA完整性分析。

1.5.3 16S rDNA序列PCR扩增采用16S rDNA特异性引物F27/R1492扩增，F27:5‘一AGAGTTTGATCNTGGCTCAG-3'，81492:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，扩增产物长度为1 500 by。反应体系25浏:DNA 1.0 u1·10 X buffer 2.5}1，25 mmol/L MgCh 3.0 Fcl，5 Uj,ul Taq polymerase 0.2}1，10 mmol/L dNTP mix 1.0}I,10 umol/L引物各1.0}}1,ddH20 15.3拼1。扩增参数:9 5 0C变性5 min,35个热循环(950C 45 s,520C 45 s,720C 45 s),720C延伸10 min0 

1.5.4 16S rDNA序列测定及分析将PCR扩增产物送至上海生工测序.将YL08菌株16S rDNA测序结果在NCBI网站上使用BLAST程序比对，从GenBank数据库中获得标准序列数据，采用MEGAS软件绘制系统发育树。

2结果

2.1细菌形态学及低营养抗逆特性的鉴定Y工一08菌株在I_B培养基上35℃培养48 h后.菌落呈乳黄色、圆形、隆起、不透明、边缘整齐、有粘性。细菌镜检(X 1000结果显示YL08分离株呈短小杆状，革兰氏染色呈阴性。YL08菌株在无营养条件下的抗逆生存能力极强，在无营养的PBS缓冲液中至少可以生存6个月而不会死亡。

2.2基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测用质量分数为。.8%的琼脂糖凝胶对YL08菌株的基因组DNA作电泳检测，通过凝胶成像分析系统照相并观察，结果见图1，在约23 kb处出现YL08基因组DNA目标条带，可以满足后续16S rDNA扩增的需要。

2.3基因组DNA的定量检测紫外分光光度计检测YL08菌株基因组DNA的制备效率，结果显示DNA浓度和纯度较好，DNA浓度为98.6 ng/尽，OD26o/0D28。一1.88}

2.4 16S rDNA的PCR扩增结果以Y工08菌株基因组DNA样品为模板，采用特异性引物F27/R1492进行PCR扩增，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测(见图2)，在1 500 by处出现特异性条带，且无明显拖尾现象，说明PC.'R扩增成功，能满足后续测序的需要。

2.5 16S rDNA序列分析将YL08菌株16S rDNA的PCR扩增产物测序，并经BLAST同源性检索，结果显示该序列与嗜麦芽寡养单胞菌的相应序列的同源性99.900;系统进化树分析(图3)证实YL08菌株与嗜麦芽寡养单胞菌的亲缘关系最近，其遗传距离为0.0010 

3讨论

本研究证实了我室从流式细胞仪流动室中分离得到YL08菌株为嗜麦芽寡养单胞菌。嗜麦芽寡养单胞菌为条件致病菌和医院感染菌，具有较强的耐药性和抗逆性[2]，采用次氯酸钠法对流式细胞仪的流动室进行常规消毒维护，无法将其彻底灭杀。因此，为避免嗜麦芽寡养单胞菌的残留对流式检测结果的影响，在采用流式细胞术检测临床血液标本后，可以考虑适当添加嗜麦芽寡养单胞菌敏感的消毒剂，以杜绝该类细菌的残留。本研究同时还证实了YL08分离株具有强大的低营养抗逆特性，在无营养的PBS缓冲液中可以存活半年以上。逆境环境下，微生物可以通过在生物体内大量储备抗逆因子(如海藻糖等生物活性物质)来帮助生物体抵御外界不良环境的伤害，使之在一种极低的新陈代谢状态中长期生存，这些抗逆因子对生物起着不可替代的抗逆境保护作用。此外，一些贫营养水体中的微生物大多具有高效的丙氨酸运输系统，而缺乏对一些关键代谢中间物(如琉拍酸)的运输系统.l嗜麦芽寡养单胞菌YL08分离株之所以可以在无营养的PBS缓冲液中长时间存活，是基于其抗逆因子介导的抗逆保护机制还是基于其独特的能量运输系统，这将是本课题组今后对YL08分离菌抗逆分子机制研究的主要方向。综上所述，本研究从流式细胞仪流动室中分离得到1株具有低营养抗逆特性的嗜麦芽寡养单胞菌YL08株，这将为流式细胞仪的消毒维护及Y工08分离株的低营养抗逆保护机制研究奠定基础。

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