RNA干扰沉默B细胞特异的莫洛尼白血病病毒插入位点1基因对前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的影响

B细胞特异性莫洛尼白血病病毒插人位点I(Bmi-1)基因属于多梳基因(PcG)家族成员之一,它的表达增高与肿瘤密切相关,其表达上调促使机体细胞癌变,Bmi-1作为一种原癌基因,在细胞周期、DNA修复、细胞分化中起关键作用,参与肿瘤干细胞转化、上皮一间质转化和肿瘤形成.目前已在人类多种恶性肿瘤中发现有Bmi-1基因高表达,如神经母细胞瘤、结直肠癌、膀眺癌等.我们应用RNA干扰(siRNA)技术沉默Bmi-1基因的表达,观察该基因沉默后对前列腺癌PC-3细胞增殖及凋亡的影响.
　　材料与方法
　　1.材料:前列腺癌细胞株PC-3由本室保存〔来源于美国全球生物资源中心(ATCC)];针对Bmi-的siRNA靶序列(Bmi-1-siRNA)根据文献〔6」报道及GeneBank中人Bmi-1基因,nRNA序列(NM005180)经BLAST同源性分析,由上海生工生物工程公司合成脂质体Lipofectamine2000购自美国lnvitrogen公司;鼠抗人Bmi-1单克隆抗体购自美国Abgent公司;嘎哩蓝(MTT)购自美国MolecularProbes公司;膜联蛋白V(AnnexinV)一异硫氰酸荧光素(FITC)细胞凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司;RPMI1640培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(FB匀等购自美国Gibe.公司.
　　2.细胞培养与.iRNA转染:将冷冻保存于液氮中的前列腺癌细胞株PC-3复苏后接种于含I0i}新生胎牛血清的RPMI1640培养基中,在370C,5}}}CO培养箱内生长,用胰酶消化细胞传代取对数生长期的PC-3细胞,调整细胞浓度为1x106/L接种6孔培养板,370C,5%aCO}孵育24h,随机分为实验组、阴性对照组、空自对照组,采用I,ipofectamine}`}2000脂质体分别转染Bmi-l-siRNA、无义对照序列}iH\-1(nonsense-siRNA)、空白脂质体,每组设3个复孔转染6h后更换成RPMI1640培养液,继续常规培养,481:后收集细胞.
　　3.逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测Bmi-1mRNA表达:转染48h后提取细胞总RNA并将其逆转录成cDNA,设计与合成Bmi-1引物序列[游:5'-AATCTAAGGAGGAGGTGA-3',下游:5'-CAAACAA-GAAGAGGTGG:A-3',PCR扩增Bmi-1cDNA,扩增的片段长度为359帅,产物经琼脂糖凝胶电泳分析.
　　4.Westernblot法检测PC-3细胞RNAi干扰前后Bmi-1蛋白的表达:收集各组细胞,蛋白提取液提取蛋白,Bradford法测蛋白含量.每个泳道30},g蛋自进行十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE),转硝酸纤维素(NC)膜,加人1:500}t};抗人Bmi-1单克隆抗体,4℃下孵育过夜;再用1:2000山羊抗鼠坛G二抗孵育1h二氨基联苯胺(DAB)显色,Bio-Rad凝胶成像系统摄影以汗肌动蛋白(日-actin)作为内参照.QuantityOne软件分析Bmi-1与p一actin条带的灰度比值,即Bmi-1蛋白相对表达量.
　　5.PC-3细胞体外增殖活力检测:采用M'I'T法.取对数生长期的PC-3细胞,转染前24h按5x103个/孔细胞传代至96孔板,其后按上述分组及96孔板说明参数进行转染,转染6h后加人完全培养基,培养12,24,48,72h后每孔加人质量浓度为5彭L的MTT300,1,37℃作用4h,磷酸}h缓冲液(PBS)轻微洗涤2次后每孔加人150闪二甲基亚枫(DMSO),振荡15min使结晶充分溶解.在酶标仪测定570nm波长下的吸光度(A)值.以:4值为纵坐标,培养时间(h)为横坐标绘制细胞生长曲线细胞生长抑制率(%)=(1一实验组.A值/空白对照组A值)x100%.
　　6.流式细胞仪检测细胞的凋亡:、收集转染后48h各组细胞,用PBS洗涤细胞2次,收集5x1旷个细胞.加人400闪的结合缓冲液悬浮细胞,再加人5AnnexinV-FITC混匀后,加人50,1碘化丙锭(PI),混匀室温避光反应10-15min在1h内,进行流式细月包仪的观察和检测.
　　7.统计学方法:应用SPSS11.0统计软件分析.结果以均数士标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用t检验.
　　结果
　　1.R'T-PCR检测Bmi-1mRNA的表达:实验组前列腺癌PC-3细胞中Bmi-1mRNA表达受到抑制,而阴性讨照组和空日讨照织PC-3细胞中都存在Bmi-1mRNA表达(图1).
　　2.B1111-1J的表达:Westernblot的结果与RT-PCR的结果一致,阴性对照组和空白对照组PC-3细胞中Bmi-1蛋白呈现高表达,而转染Bmi-l-siRNA的实验组PC-3细胞中,Bmi-1蛋白被显著抑制(图2)0实验组、阴性对照组、空白对照组Bmi-1蛋白相对表达量分别为(20.0士2.6)%,(71.5士7.8)%,(73.4士6.1)%,实验组显著低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05),阴性对照组和空白对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)与空白对照组比较,实验组Bmi-1蛋白抑制率为72.8%.上述结果表明,无义序列nonsense-siRNA对Bmi-1mRNA和蛋白质的表达无影响,干扰序列Bmi-1-siRNA对Bmi-1mRNA和蛋白质的表达均有明显的抑制作用.
　　3.iV1TT法检测细胞增殖活性:细胞生长曲线显示,转染后24}72h,实验组细胞生长速度较空白对照组和阴性对照组明显减慢,后两组细胞生长差异无统计学意义(P>o.os}(图3)转染后72h,实验组PC-3细胞生长抑制率为(31.40士1.02)%,与对一照组比较,实验组细胞生长抑制率增加(P<0.05),而阴性对照组与空白对照组细胞生长抑制率差异无统计学意义(P>O.O5,表1).
　　4.Bmi-I-siRNA干扰PC-2细胞后对其凋亡的影响:48h后,实验组细胞凋亡率为(23.77士2.23)%,与空自对照组[(7.03士0.88)0lc〕和阴性对照组汇(6.89士1.02)%」比较,实验组细胞凋亡率明显增加(P<0.05).这表明干扰Bmi-1基因表达后促进了PC-3细胞的凋亡.
　　讨论
　　Bmi-1基因属于PcG成员,首次被提出是在转基因鼠的淋巴瘤细胞传代中,可与c-my.协同作用引起细胞转化和肿瘤形成〔7一吕es.肿瘤转移是前列腺癌引起死亡最主要的原因之一,其中,肿瘤细胞发生上皮一间质转化与肿瘤干细胞增殖是参与肿瘤侵袭转移的重要机制.研究结果显示大量表达的Bmi-1基因和前列腺特异抗原(PSA)一样可以作为前列腺癌患者不良预后因素之一l}}}Bmi-I基因在调控转录中通过抑制INK4a-ARF基因而参与肿瘤的形成和肿瘤干细胞的自我更新.文献报道Bmi-1的过表达会引起肿瘤抑制因子第10号染色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸醋酶基因抑癌基因(PTEN)的减少,可通过磷酸肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/糖原合成激酶3p(GSK-3p)/Snail通路,引起E一钙豁蛋白(E-cadherin)下调,启动上皮间质转化过程,增加上皮细胞的移动性川,而这正是癌症人侵的一个关键性细胞过程此外,Bmi-1基因还可在调控转录中通过抑制IiVK4a-ARF基因而参与肿瘤的形成和肿瘤干细胞的自我更新.且研究结果显示过表达的Rmi-1基因和PSA一样可以作为前列腺癌患者不良预后因素之一,提示Btni-1基因在前列腺癌的发生发展中可能起重要作用本研究结果显示,当PC-3细胞中Bmi-1蛋白的表达受到抑制后,PC-3细胞的增殖受到抑制,同时细胞周丁明显增加本研究结果表明,Bmi-1基因参与了前列狼癌的形成和演化过程,因此,Bmi-1的作用可能不仅仅是诱发前列腺癌细胞的局部增殖分化,并可能在诱导前列腺癌侵袭转移及上皮一间质转化现象具有更重要的作用.
　　参考文献
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