槲皮素对大鼠非酒精性脂肪性肝病的疗效及其机制 　　

随着人们生活条件的改善、饮食结构的改变、老龄化人口增加以及对疾病监测手段的提高,非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已经成为我国发达地区临床最常见的肝病,在国外成人的发病率达20%~33%;其中75%~90%与病态的肥胖相关,3%~5%将发展为非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化和肝癌。但其发病机制尚未完全明确,也缺乏有效的治疗药物。近年来,炎症细胞因子在其发病机制中的作用越来越受到重视。白细胞介素(IL)18是脂肪组织分泌的促炎细胞因子;IL-10则是重要的抗炎细胞因子,二者之间的动态变化在一定程度上可反映机体的炎症反应状况。槲皮素具有多种药理活性,本研究拟观察其对NAFLD大鼠炎症细胞因子及其肝组织病理学的影响,期望为NAFLD的临床防治提供理论依据。
　　材料与方法
　　1.动物:无特殊病原级雄性SD大鼠100只,体质量(1O0±25)g,购自桂林医学院动物实验中心,分笼饲养在湿度为40%、温度为28℃左右的动物实验室内,自由进食进水。
　　2.试剂:槲皮素购自上海佳和生物科技有限公司;IL-18、IL-10的酶联免疫吸附法(ELISA)试剂分别购自北京中杉金桥生物技术有限公司、深圳达科为生物技术有限公司。丙二醛（MDA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所,丙硫氧嘧啶片购自上海复星朝晖药业有限公司,胆固醇购自成都科龙化工试剂厂。
　　3.动物模型制备:将100只SD大鼠喂养1周后按体质量完全随机分为正常对照组(30只)和高脂组(70)。正常对照组给予普通饮食,高脂组给予高脂饮食(胆固醇2%+蛋黄粉5%+猪油1%+丙硫氧嘧啶0.2%+72.8%普通饲料)。每周称体质量1次,4周末两组各处死10只大鼠,处死后立即腹主动脉取血,并留取肝脏。游离肝脏并去除包膜,迅速称肝湿重,计算肝指数[肝指数=肝湿重(g)/体质量(g)×100%。腹主动脉取血后,以3000r/min离心15min分离血清,-80℃保存备用,所有血清标本同批测定。通过血清学指标甘油三酯(TG)、空腹血糖、IL-18、MDA的变化及肝脏病理组织学的改变确定造模成功与否。造模成功后将高脂组剩下的60只随机分为模型对照组(模型组)、低剂量槲皮素治疗组(低剂量组)1高剂量槲皮素治疗组(高剂量组),每组20只。
　　4.药物干预:槲皮素低剂量组:75mg.kg-1.d-1;高剂量组:300mg.kg-1.d-1;正常组、模型组:用等量等渗盐水灌胃。整个过程正常对照组给予普通饲料,其他各组给予高脂饮食。于第12周末(即给药的第8周末)处死各组大鼠,取材同方法3。
　　5.血清生物化学指标检测:大鼠血清TG和FBs采用酶法由本院的全自动生物化学检测仪测定。
　　6.血清IL-18、IL-10、MDA检测:采用ELISA法测定血清IL-18、IL-10水平;采用硫代巴比脱酸法测定MDA。具体步骤严格按照说明书操作。
　　7.免疫组织切片检测:肝左叶经10%甲醛溶液固定24h,常规脱水、石蜡包埋,切片厚度约4um。切片常规HE染色,脱水、透明、封片。结果判断:由同一位病理科医师在光学显微镜下观察,作出单盲判断。肝脏病理组织学脂肪变的诊断参照“非酒精性脂肪性肝病诊疗指南2010年修订版)”。并根据小叶内肝细胞脂肪变的情况将脂肪肝程度量化:0分(肝细胞内无脂滴沉积)、1分(肝小叶内<30%的肝细胞有脂肪变)、2分(肝小叶内30%~50%的肝细胞有脂肪变)、3分(50%~70%的肝细胞有脂肪变)、4分(75%以上的肝细胞有脂肪变);炎症活动度计分:按汇管区炎症、小叶内炎症、碎屑坏死及桥接坏死(包括多小叶坏死ˇ项指标,再依病变程度分别计为1、2、3、4分)。
　　8.统计学方法:数据以均数±标准差臼±x表示,采用SPSS19.0统计软件进行分析。正常组与模型组间均数比较用t检验;槲皮素治疗前后各组间进行单因素方差分析,用LSD-t检验进行网网比较;相关分析用Pearson法。以P<0.05为差异有统计学意义。
　　结果
　　1.高脂喂养对大鼠肝指数、FBS、TG、IL-18、IL-10、MDA的影响:与正常组比较,第4周末大鼠肝指数、FBS、TG、IL-18水平均明显升高（P<0.05),IL-10水平降低(P<0.05),MDA变化不明显。随着高脂喂养时间的延长,第12周末时模型组大鼠FBs、TG、IL-18进一步升高,MDA亦显著升高,IL-10则继续下降(P<0.05)。
　　2.高脂喂养对大鼠肝脏病理组织学的影响:正常组大鼠肝脏形态、质地、颜色均正常。高脂喂养组的肝脏体积增大,外形饱满圆钝,色泽灰黄,切面油腻,质地较脆;光学显微镜下显示大鼠肝小叶结构破坏,肝索排列紊乱,肝细胞明显脂肪变性,胞质内充满脂滴空泡,并可见淋巴细胞及少数中性粒细胞浸润,其病理学改变随着高脂喂养时间延长进一步加重。
　　3.4周模型组大鼠血清IL-18、IL-10水平与脂肪变、炎症程度的相关性:相关分析结果提示IL-18水平与炎症程度呈正相关,IL-10水平与炎症程度和脂肪变性程度呈负相关。4.槲皮素治疗前后各组大鼠相关指标的变化情况:高、低剂量组与模型组比较,肝指数、FBS和L-18水平均下降(P值均<0.01)、IL-10水平上升(P<0.05);高剂量组大鼠TG、MDA水平下降(P<0.05),低剂量组大鼠TG、MDA无明显变化。高剂量与低剂量组比较,肝指数、FBs、IL10的变化无统计学意义(P>0.05),但TG、L-18及MDA显著下降(P<0.05),提示高剂量组治疗效果更好。
　　5.槲皮素治疗后各组大鼠肝脏病理学变化:光学显微镜下显示:槲皮素治疗组大鼠肝组织脂肪变以轻度、中度为主,脂肪变及炎症程度积分较模型组显著下降(P<0.05),且高剂量组治疗效果更好(P<0.05)。
　　讨论
　　目前,NAFLD模型应用较多的是高脂饮食或基因敲除,但真正模拟人类代谢综合征及NAFLD的动物模型还在不断完善之中。本研究通过高脂饮食成功构建了NAFLD大鼠动物模型,模型组大鼠肝指数、FBS、TG、IL-18水平上升,IL-10水平下降,且随着造模时间的延长,MDA亦明显升高,提示体内有氧化应激反应。
　　我们前期研究结果提示IL-18在NAFLD的发生、发展中可能起着重要作用;而I⒈10的含量较对照组低,用脂多糖处理后,IL-10的mRNA会进一步下降,对促炎因子的抑制作用减弱,炎症可进一步加重;此外,肝硬化经治疗好转的患者其IL-10水平升高。IL-10水平升高,则减弱了炎症细胞因子的表达、胰岛素信号的恶化和L哑&g血c通路的阻滞。本研究结果显示:NAFLD大鼠存在高血糖、高血脂,且致炎因子水平升高、抗炎因子水平降低;IL-18水平与炎症程度呈正相关,IL-10水平与炎症和脂肪变性程度呈负相关。
　　目前,NAFLD的治疗尚无特效药物,其临床治疗主要包括:胰岛素增敏剂、调节血脂药、抗氧化剂和熊去氧胆酸等,但收效甚微。促炎和抗炎因子失衡、胰岛素的抵抗和氧自由基的大量产生是NAFLD发病过程中致肝细胞损伤的重要病理生理基础;因此,通过调节NAFLD亚临床炎症状态,改善胰岛素的抵抗,有可能达到干预和治疗NAFLD的目的。槲皮素具有较强的抗炎、抗纤维化以及抗氧化应激作用;对人类肿瘤、心血管疾病等退变性疾病的治疗和预防均有重要意义。
　　本研究结果显示:槲皮素可降低血糖、血脂和IL-18水平,减轻氧化损伤,提高IL-10水平,调节炎症细胞因子的失衡,进而减少炎症的发生。病理组织切片也显示肝脏炎症得以明显改善,大鼠肝细胞索排列较治疗前有序,胞质和内质网中脂肪微囊泡减少,脂滴缩小,汇管区及周围炎症细胞减少。另外,实验数据显示治疗效果与使用的剂量有关,高剂量组效果更明显。但是,是否剂量越大效果越好,最佳治疗剂量的确定以及药物的安全性尚待进一步研究。
　　参考文献
　　1.Angulo P. GI epidemiology:nonalcoholic fatty liver disease[J].Alimentary Pharmacology and Therapeutics,2007.883-889.
　　2.中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组. 非酒精性脂肪性肝病诊疗指南(2010年修订版)[J].中华肝脏病杂志,2010,(3):163-166.doi:10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2010.03.002.
　　3.范建高,钟岚,曾民德. 金牡蛎对大鼠高脂血症脂肪肝的防治作用[J].中国海洋药物,1999,(02):9-11.
　　4.王泰龄,刘霞,周元平. 慢性肝炎炎症活动度及纤维化程度计分方案[J].中华肝脏病杂志,1998,(4):195-197.doi:10.3760/j.issn:1007-3418.1998.04.002.
　　5.乔梁,范建高. 非酒精性脂肪性肝病动物模型的评价[J].中华肝脏病杂志,2008,(11):806-808.doi:10.3321/j.issn:1007-3418.2008.11.003.
　　6.Cintra DE,Pauli JR,Araújo EP. Interleukin-10 is a protective factor against diet-induced insulin resistance in liver[J].Journal of Hepatology,2008.628-637.
　　7.厉有名. 非酒精性脂肪性肝病的治疗进展[J].中华肝脏病杂志,2008,(11):816-817.doi:10.3321/j.issn:1007-3418.2008.11.007.
　　8.Egert S,Wolffram S,Bosy-Westphal A. Daily quercetin supplementation dose-dependently increases plasma quercetin concentrations in healthy humans[J].Journal of Nutrition,2008.1615-1621.