Fas/Fas配体系统及其下游信号转导通路的激活促进酒精性肝炎及酒精性肝纤维化的进展

细胞凋亡是肝损伤的发病机制之一,但在酒精跬肝炎和肝纤维化发生、发展过程中,细胞凋亡的主导调控基因及调控机制尚不十分清楚,因此,亦缺乏有效的靶向性调控药物及基因治疗措施。我们采用含4%(V/V)乙醇Lieber-DeCarli液体饲料联合微量CC1建立小鼠酒精跬肝炎和肝纤维化模型;观察Fas/Fas配体系统及其下游相关基因表达的变化及其在该病进展中的作用,以进一步阐明酒精跬肝病的发病机制。
　　材料与方法
　　1.动物模型建立和标本采集:选用7~8周龄健康雄性C57BL/6J小鼠18只,体质量20~25g(购自北京军事医学科学院),采用完全随机法分为3组:对照组,以对照液体饲料喂养4周;酒精性肝炎组,以含4%(V/V)乙醇(购自河北衡水老白干酒业股份有限公司)的Lieber-DeCarli液体饲料喂养4周;酒精性肝纤维化组,以含4%(V/V)乙醇的Lieber-DeCarli液体饲料喂养8周,并自第5周联合应用5%CC1橄榄油溶液2ml/kg,2次/周,腹腔注射。Lieber-DeCarli乙醇液体饲料热量构成比(V/V):乙醇36%,蛋白质18%,脂肪35%,碳水化合物11%;对照饲料:以等热量麦芽糊精代替乙醇。分别于第4周和第8周处死实验小鼠,留取血清及肝组织标本,部分肝组织用4%中性甲醛溶液固定,其佘肝组织以液氮快速冷冻,-80%保存备用。
　　2.肝组织病理学观察:肝组织石蜡包埋,常规组织切片(5um),行HE及Masson染色,光镜下观察肝脂肪变、炎症及肝纤维化程度。肝组织损伤程度依据《酒精性肝病诊疗指南2010年修订版)》及Domingguez等制定的酒精性肝病组织学评分系统判断。
　　3.凋亡细胞检测:采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测。常规组织切片,脱蜡、水化后,焦炭酸二乙酯水溶液处理30min以淬灭内源眭核酸内切酶,按产品说明书进行TUNEL染色。于400倍光学显微镜下随机观察10个视野,计算阳性细胞平均数计为凋亡细胞数。
　　.4。Fas、FasL、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3及细胞色素P450的mRNA表达检测:应用逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)分析,各基因引物序列见。采用Trizol试剂(购自北京天根生化科技有限公司)一步法提取肝组织总RNA,以寡脱氧核苷酸和bΙⅣLV逆转录酶(购自加拿大Fermentas公司)制备cDNA,用TaqDNA多聚酶(购自北京天根生化科技有限公司)PCR扩增cDNA产物,以1.5%琼脂糖电泳分离扩增产物,溴化乙啶染色后以Bioprofif凝胶图像分析系统定量分析,以相关基因与GAPDH的灰度比值作为该基因的检测值。
　　5.肝组织Fas、FasL、caspase3及CYP 2E1的蛋白质表达检测:(1)Fas及caspase3表达:采用Westernblot检测。以含蛋白酶抑制剂的组织裂解液提取肝组织蛋白,紫外分光光度计(购自美国Thermo公司)测定蛋白质浓度,取100ug蛋白经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,转移到聚偏二氟乙烯膜,5%脱脂奶粉封闭,分别与小鼠Fas、caspase3抗体(1∶500)反应后与相应的辣根过氧化物酶标记的免疫球蛋白G抗体(1∶10000)进行免疫反应,化学发光显色,胶片曝光显影,以β-肌动蛋白(β-actin)为内参照,用美国Kodak公司D数码成像分析系统软件对Westernblot结果进行分析,结果以目的蛋白与β-actin的积分A比值表示。（2）FasL、CYP 2E1蛋白表达:应用免疫组织化学染色法检测,采用即用型二步法检测试剂盒（PV-6000),以PBS代替第一抗体为阴性对照,棕黄色为阳性着色,光镜下观察肝组织FasL和CYP 2E1蛋白表达情况。
　　6.统计学方法:实验数据以均数±标准差臼±x表示。用SPSS13.0软件进行统计分析,多组样本均数间差异比较用单因素方差分析或Kruskal-WallisH检验,组间比较用LSD-t检验或Mann-WhitneyU检验,P<0.05为差异有统计学意义。
　　结果
　　1.实验小鼠肝组织病理学变化:对照组小鼠肝组织病理学无明显异常;Lieber-DeCarli乙醇液体饲料喂4周,可见轻至中度肝细胞大泡性脂肪变及肝细胞水样变,小叶内点、灶状坏死伴炎细胞浸润;喂养8周,点灶状肝细胞坏死及炎细胞浸润加重,并可见片状肝细胞坏死,窦周及中央静脉周围纤维组织沉积,汇管区扩大,纤维组织向小叶内延伸,形成桥接纤维化。
　　2.实验小鼠肝细胞凋亡指数:TUNEL分析结果显示,对照组、酒精性肝炎组和酒精性肝纤维化组小鼠肝组织切片凋亡细胞数分别为每高倍视野(0.20±0.13)个、(1.10±0.23)个和(2.90±0.31)个,酒精性肝纤维化组明显高于酒精性肝炎组及对照组(F=33.136,P<0.05)。
　　3.实验小鼠肝组织Fas、FasL、caspase3及CYP 2E1的mRNA及蛋白表达:酒精性肝纤维化组小鼠肝组织Fas、FasL、caspase3、CYP 2E1的mRNA及蛋白质表达呈一致趋势,酒精性肝纤维化组明显高于酒精性肝炎组及对照组,;免疫组织化学染色结果显示,FasL主要表达于肝细胞胞质和细胞膜,CYP 2E1主要表达于肝细胞质内;FasL及CYP 2E1阳性细胞主要分布于中央静脉周围的坏死性炎症病灶附近。
　　讨论
　　Fas/FasL系统是调节细胞凋亡的主导基因调控系统之一,其激活可诱导下游外源性和内源性细胞凋亡信号通路的同时激活,诱发肝细胞凋亡而导致肝脏炎症及纤维化的发生和进展。本研究结果证实,随着实验小鼠酒精性肝炎和肝纤维化的进展,Fas、FasL基因的表达明显增强,尤以酒精性肝纤维化组表达上调显著,提示Fas/FasL系统在该病的发生、发展中具有重要作用。
　　酒精性肝炎和肝纤维化包括肝细胞脂肪变、脂质过氧化、氧化应激及由此导致的肝细胞凋亡、坏死性炎症和纤维组织增生等系列病变。我们前期对非酒精性脂肪性肝病的研究结果已证实,Fas/FasL及其下游的caspase级联信号转导通路是调节细胞凋亡的主导信号转导通路,在肝脂肪变、脂肪性肝炎早期即明显上调,伴随肝损伤的进展而逐渐增强,而抗氧化治疗可抑制其表达、改善肝脏脂肪变、炎症及纤维化。本研究结果显示,乙醇联合微量CCl可导致肝脏炎症及纤维化的形成,提示氧化应激反应可能是酒精性或非酒精性脂肪性肝病诱导Fas/FasL表达上调的重要因素。
　　CYP为血红素蛋白超家族成员之一,在氧化酶系统中作为终末期氧化酶对多种内源性底物进行代谢,包括类固醇,脂肪酸,毒物及药物等。CYP 2E1是ROS的重要来源,脂肪酸和乙醇是CYP 2E1的诱导物及作用底物,反映乙醇氧化代谢发生氧化应激的水平。本研究结果显示,CYP 2E1在酒精性肝炎发生早期即有表达,在酒精性肝纤维化组小鼠表达明显增加,表明CYP 2E1在酒精性肝炎和肝纤维化进展中起重要作用。其可能的机制为,乙醇及其代谢产物通过直接或间接的方式破坏线粒体呼吸链,线粒体功能破坏导致促凋亡蛋白CYP 2E1释放,并与凋亡蛋白活化因子及caspase9形成活化的凋亡复合体,激活下游的caspase3导致细胞凋亡。
　　本研究结果显示,对照组、酒精性肝炎组、酒精性肝纤维化组小鼠Fas/FasL表达水平逐渐增高,caspase3及CYP 2E1表达与Fas/FasL呈一致趋势,肝细胞凋亡数亦呈依次增高趋势。免疫组织化学染色结果显示,FasL、CYP 2E1主要表达于中央静脉周围的坏死性炎症病灶区域,表明在Lieber-DeCarli乙醇液体饲料加微量CCl导致的复合型酒精性肝损伤模型中,凋亡基因Fas/FasL基因的表达上调及其下游凋亡信号转导通路的激活可导致肝细胞凋亡,进一步导致肝脏炎症及纤维化的发生与进展。其可能的机制为:(1)乙醇及其代谢产物可导致肝脂肪变、脂质过氧化物产生增多,诱发氧化应激反应激活Fas/FasL系统及其下游的外源性细胞凋亡信号转导通路;(2)过多的反应性氧化物可损伤线粒体功能,使CYP 2E1释放增多,进一步激活凋亡效应基因caspase3,诱导肝细胞凋亡;(3)乙醇及其代谢产物乙醛激活枯否细胞,释放转化生长因子β1、肿瘤坏死因子α及血小板衍生的生长因子等促炎、促纤维化因子,诱导肝星状细胞活化与增殖,产生细胞外基质增多,形成肝纤维化。
　　上述研究结果表明,Fas/FasL系统及其下游信号转导通路激活可能是酒精性肝炎/肝纤维化中诱导肝细胞凋亡的主导信号转导通路,其激活可通过外源性与内源性双重通路激活细胞凋亡效应基因caspase3,导致肝细胞凋亡,进一步促进肝脏炎症及纤维化的发生与进展。
　　参考文献
　　1.中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组. 酒精性肝病诊疗指南(2010年修订版)[J].中华肝脏病杂志,2010,(3):167-170.doi:10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2010.03.003.
　　2.Dominguez M,Rincón D,Abraldes JG. A new scoring system for prognostic stratification of patients with alcoholic hepatitis[J].American Journal of Gastroenterology,2008.2747-2756.
　　3.Guengerich FP. Oxidative cleavage of carboxylic esters by cytochrome P-450[J].Journal of Biological Chemistry,1987.8459-8462.
　　4.Nan Y,Wang R,Zhao S. Heme oxygenase-1 prevents nonalcoholic steatohepatitis through suppressing hepatocyte apoptosis in mice[J].LIPIDS IN HEALTH AND DISEASE,2010.124.
　　5.Raucy JL,Lasker J,Ozaki K. Regulation of CYP 2E1 by ethanol and palmitic acid and CYP4A11 by clofibrate in primary cultures of human hepatocytes[J].Toxicological Sciences,2004.233-241.
　　6.Riedl SJ,Shi Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology,2004.897-907.
　　7.Lu Y,Zhuge J,Wang X. Cytoehrome P450 2El contributes to ethanol-induced fatty liver in mice[J].Hepatology,2008.1483-1494.
　　8.南月敏,韩芳,孔令波. 过氧化物酶体增殖物激活受体γ抗肝细胞凋亡的机制[J].中华肝脏病杂志,2011,(7):521-526.doi:10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2011.07.013.
　　9.Yuan J,Horvitz HR. A first insight into the molecular mechanisms of apoptosis[J].Cell,2004,(2 Suppl):S53-S56.
　　10.Delhalle S,Duvoix A,Schnekenburger M. An introduction to the molecular mechanisms of apoptosis[J].Annals of the New York Academy of Sciences,2003.1-8.