姜黄素联合伊立替康对大肠癌Lovo细胞体外生长的影响

姜黄系姜科植物姜黄的干燥根茎，其主要化学成分姜黄素是一种多酚类化合物。姜黄素药理作用包括抗肿瘤、逆转肿瘤对化疗药物产生的多药耐药、抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗艾滋病毒等作用。我们使用姜黄素联合伊立替康，作用于大肠癌Lov。细胞，观察姜黄素是否可以增强伊立替康对lov。细胞的杀伤作用，探讨姜黄素与伊立替康是否具有协同作用。
　　材料与方法
　　1材料:人结肠腺癌Lovo细胞株(中山大学细胞库，ATCC建株);RPMl1640培养基(HyClone公司，美国);胎牛血清、0.25%胰酶溶液+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA，美国Gibc。公司);姜黄素、唾哩蓝(MTT),二甲基亚}J},(DMSO)溶液(美国Sigma公司);磷酸盐缓冲液(PBS，中国Boste:公司);膜联蛋白V(AnnexinV)-异硫氰酸荧光素(FITC),碘化丙锭(Pl，中国KeyGEN公司);盐酸伊立替康(江苏恒瑞公司，中国)。1169生物安全柜(美国Thermo公司);细胞培养箱(英国GalaxyR公司);MS全自动酶标仪(MDS，美国);流式细胞仪(美国BD公司)。
　　2.姜黄素对Lov细胞增殖的影响:(1)细胞培养与分组:将处于对数生长期细胞按5x103个/孔细胞种人96孔板中，设立8个实验组、1个阴性对照组、1个空白对照组，每组有6个复孔，8个实验组分别用完全培养基将姜黄素溶液按浓度1.25,2.50,5.00,10.00,15.00,20.00,30.00,40.00m彭L配制分组，使溶媒DMSO终质量浓度<0.1%，阴性对照组(完全培养基+相同浓度的DMSO+Lovo细胞)、空白对照组(完全培养基+相同浓度的DMSO)，置37℃孵箱培养过夜。(2)给药培养方式:按上述分组方法将相应的培养液加人各组培养孔中，100闪/孔，作用时间为24,48,72,96120h，每隔24h换取新鲜培养液。(3)MTT法检测Lovo细胞增殖水平:每孔加入20闪M'I`T(5群L，用PBS配制，过滤除菌)，避光培养4h。吸去培养液，加入150},IDMSO，震荡10min，在M5全自动酶标仪上采用双波长570nrn测定各孔吸光度(A)值，剔除异常值后取平均值，并按以下公式计算各实验组抑制率(%):抑制率(%)二「1一(实验组A值一空白对照组A值)/(阴性对照组A值一空白对照组A值)}X100%,结果以作用时间为横坐标，细胞抑制率为纵坐标，绘制各个浓度的细胞时间生长抑制曲线。筛选出姜黄素对Lovo细胞增殖无抑制作用的最大浓度。
　　3.伊立替康对Lov。细胞增殖的影响:(1)细胞培养与分组:细胞培养同上。设立7个实验组、1个阴性对照组、1个空白对照组，每组有6个复孔，7个实验组用完全培养基将伊立替康溶液按浓度1.925,3.850,7.700,15.400,30.800,61.600,132.200m郭L配制分组，阴性对照组(完全培养基+Lov。细胞)、空白对照组(完全培养基)。(2)给药培养方式:同上。(3)MTT法检测Lov。细胞增殖水平:同上，并用统计软件SPSS13.0计算出不同时间点伊立替康对Lovo细胞的半数抑制浓度(ICSO)。
　　4.姜黄素联合伊立替康诱导Lovo细胞凋亡的凋亡率:(1)两药混合法:分别设立姜黄素单药组、伊立替康单药组、姜黄素十伊立替康联合组，每组设立6个复孔。所有组中姜黄素药物浓度为第I步得出的姜黄素对Lovo细胞增殖无抑制作用的最大浓度，伊立替康药物浓度为伊立替康对Lovo细胞的24hICS。值，姜黄素+伊立替康联合组为姜黄素溶液与伊立替康溶液按1:1比例配制。各组分别共同培养24,48h后，终止作用，PBS液洗净药液，用0.25%胰酶消化液(不含EDTA)消化制成细胞悬液。(2)贯序给药法:分别设立2个实验组、1个阴性对照组，每组设立6个复孔，2个实验组分别为第1步得出姜黄素对Lov。细胞增殖无抑制作用的最大浓度及其2倍浓度，阴性对照组为完全培养基+相同浓度的DMSO,3组分别培养24,48h后，终止作用，PBS液洗净姜黄素药液，加人新鲜完全培养基培养24h后，再行无菌PBS液洗净培养基，换取伊立替康(浓度为24h的ICS)继续作用24h后，PBS液洗净药液，用0.25%胰酶消化液(不含EDTA)消化制成细胞悬液。(3)流式细胞仪检测:将上述各组实验样本上机检测其凋亡率。
　　5.统计学方法:应用SPSS13.0统计软件分析。数据均以均数，标准差(无士、)表示，两组间比较采用两独立样本t检验。
　　结果
　　1.姜黄素对Lovo细胞增殖的影响(图1):不同浓度姜黄素作用于大肠癌Lov。细胞后，随着作用浓度增高，作用时间加长，Lov。细胞增殖水平明显下降，姜黄素呈时间、剂量依赖型方式抑制大肠癌细胞增殖。其中，5.00m郭L是姜黄素对Lovo细胞的增殖无抑制作用的最大浓度，在不同的作用时间点，其在570nm波长下测得A值与阴性对照组比较差异无统计学意义(P24h>0.OS、P48h>0.05、P72h>0.05、P96h>0.05、P120h>0.OS)。
　　2.伊立替康对Lov。细胞增殖的影响(图2):在不同时间段，不同浓度伊立替康对Lovo细胞的ICS。分别为ICSO2a1,=56.201mg/L、ICsoas、=21.183m岁L,ICso}2h=20.211mg/L,ICSO9ei=17.246mg/L,ICso120h=7.891m郭L，其对Lov。细胞增殖抑制方式亦呈时间、剂量依赖性。
　　3.不同给药方式联合姜黄素及伊立替康在不同作用时间诱导Lov。细胞凋亡率:(1)混合给药法:姜黄素+伊立替康联合组与伊立替康单药组对比，作用24h联合组对Lov。细胞的早期凋亡率显著高于单药组(P<0.05)，但晚期、总凋亡率差异无统计学意义(P>
　　0.05);作用48h，联合组的早期、晚期及总凋亡率均显著高于单药组(P<0.01)。(2)贯序给药法:实验组与阴性对照组比较，两组实验组对Lov<)细胞的凋亡率显著增加，并随着姜黄素的浓度增加，作用时间延长，凋亡率也显著增加(P<0.05)}(3)不同给药方式的比较:与混合给药处理组比较，作用24h，贯序给药处理组中经5.00m扩L姜黄素中伊立替康对Lo。细胞的早中晚期凋亡率均显著高于两药联合组(P<0.01);作用4$h，伊立替康对Lov。细胞的早中晚期凋亡率亦显著高于两药联合组(P<0.01，表1,2)。
　　讨论
　　我们将不同浓度的姜黄素及伊立替康处理Lovo细胞，使用MTT法检测在不同时间点姜黄素及伊立替康对Lovo细胞增殖的影响，结果显示，随着2种药物的浓度增加，作用时间延长，对Lovo细胞增殖抑制作用也增强，两者的作用方式呈时间及浓度依赖性。但浓度为5.00m扩L姜黄素对Lov。细胞的增殖失去抑制作用，由此说明，姜黄素与伊立替康都有良好的抗肿瘤作用，在细胞水平上，姜黄素的浓度需高于5.00mg/L才具有抗肿瘤作用。Wang等「z)在人大肠癌细胞株HT-29中，发现姜黄素主要通过激活半胧氨酞天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3，释放细胞色素C，使线粒体膜电位(0'}m)崩溃等相关途径，下调抗凋亡因子B淋巴细胞/白血病一2(bcl-2)及bcl-xL，上调促凋亡因子bax及bad，从而降低bcl-2/bax及bcl-xL/bad比例，从而促进了大肠癌HT-29细胞的凋亡。
　　肿瘤多药耐药是降低化疗药物疗效重要原因，而运转蛋白P一糖蛋白(P-gp)是介导各种肿瘤多药耐药的经典机制，研究结果显示姜黄素含有两种不饱和酮:o一不饱和酮、p一不饱和酮，它们可以与细胞内谷胧甘肤反应合成姜黄素一谷胧甘肤碳基化合物，抑制多药耐药基因(MDR1)的表达，降低P-gP生物合成}s}。另外，姜黄素可以抑制COPS信号复合物(CSN)一相关激酶磷酸化，使拓扑异构酶II一。在肿瘤细胞中处于高表达水平，使化疗药物与拓扑异构酶II-a结合增加〔6〕，逆转肿瘤细胞对化疗药物的多药耐药。由于姜黄素具有逆转肿瘤多药耐药的特性，现在姜黄素与化疗药物的协同作用研究是目前研究重点。本研究结果表明，姜黄素与伊立替康对Lov。细胞的抑制效应具有协同作用，姜黄素可以增强伊立替康对Lov。细胞的杀伤作用，呈浓度与时间的依赖性。并且，贯序给药法比混合给药法更有效提高伊立替康对Lovo细胞的杀伤作用。由于伊立替康的作用靶点是肿瘤细胞内的拓扑异构酶I，干扰肿瘤细胞内D1}A的复制，促使肿瘤细胞凋亡，所以，两种药物之间的协同作用机制可能是，姜黄素可能上调Lov。细胞拓扑异构酶I的表达，增加伊立替康对Lo、细胞的作用靶点，增强伊立替康对Lovo细胞的杀伤作用，但具体作用机制尚有待进一步研究。
　　参考文献
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