5-杂氮-2'-脱氧胞苷对人结肠癌细胞增殖的抑制作用及机制

DNA的甲基化是调节基因表达的一种方式，主要是通过DNA甲基转移酶(DNMT)将S一腺背甲硫氨酸上的甲基转移到胞嚓p;}第5位碳原子上，生成5一甲基胞嚓陡，因此DNMT是甲基化的关键调节点。而5-杂氮一2'一脱氧胞普(5-Aza-CdR)可以与DNMT发生特异性的共价结合而抑制其活性，发挥甲基化的调节作用。我们以结肠癌细胞作为研究对象，探讨DAB2基因在结肠癌SW480细胞上的表达及启动子胞嚓陡-磷酸一鸟镖吟基序(CpG)岛甲基化，并观察5-Aza-CdR对结肠癌细胞的影响。
　　材料与方法
　　1材料:人结肠癌细胞(S}J480)购自重庆医科大学生命研究院;5-Aza-CdR(美国Sigma公司);DMEM/H培养基(Hyclone公司);胎牛血清(美国GibcoBRL公司);兔抗人DAB2单抗(美国Eptomic公司);逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(TaKaRa公司);DNA提取试剂盒「生工生物工程(上海)有限公司];9700基因扩增仪(美国ABI公司);凝胶成像系统(美国Bio-RAD公司);激光共聚焦显微镜(德国Leica公司)。
　　2.细胞培养:人结肠癌SW480细胞株，置于DMEM/H培养基(含10%胎牛血清，1%链霉素和青霉素),370C,5%COZ饱和湿度条件下培养。5-Aza-CdR用二甲基亚飒(DMSO)充分溶解成1000N.,mol/L储存液，-80℃保存。取对数生长期的SW480细胞，用2.5扩L胰蛋白酶消化癌细胞成单细胞悬液，于显微镜下计数，按2x106/L培养传代，24h后分别用2.5,5.0,10.0E.},mol/L的5-Aza-CdR培养基培养，每天药物培养基换液。72h后收集细胞进行实验，以同体积不含药液的培养液处理细胞为对照组，培养过程中采用相差显微镜观察细胞形态变化。
　　3.流式细胞术检测细胞凋亡:细胞以药物(2.5,5.0,10.0'N,mol/L)培养72h后磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，离心后PBS重悬细胞，用细胞计数板计细胞个数后将细胞密度调至1x10}/L。取100闪细胞悬液与5闪膜联蛋白V一异硫氰酸荧光素(AnnexinV-FITC)和5},l碘化丙锭(PI)混匀后，室温、避光反应15一20min。加人200},l结合缓冲液，30min内流式细胞仪检测，各组实验重复3次。
　　4.甲基化测序聚合酶链反应(BSP)法检测DAB2甲基化:细胞处理同前，按照说明书提取细胞DNA，并用紫外分光光度计测定DNA浓度，经亚硫酸盐处理后，回收DNA，并进行扩增，扩增引物为:上游引物5'-TTTGTI"I'AAAGGGT"I"TTAACGGG-3'，下游引物5'-ACCTAAACTTAATAACTCCCCCTCA-3'，扩增长度为359by，扩增条件为:940C45s;66℃45s,72℃1min,共20个循环，再修复延伸72℃8min。产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收扩增产物连接载体，提取质粒后各组选取5个克隆位点进行测序，了解其甲基化状态。
　　5.RT-PCR检测DAB2mRNA的表达:细胞处理同前，根据操作说明用Trizol试剂提取总RNA，并用紫外分光计测定其浓度，逆转录成cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR引物序列及扩增条件分别为:DAB2上游引物:5'-TAATCCTGATCCTTTCCGTGAC-3，下游引物5'-AAGCCGTTCTGTTCTCTT"I'CAG-3',扩增片段长度为297by;以p-actin为内参，上游引物5'-GACCCAGATCATGTI"I'GAGACC-3，下游引物:5'-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3'，扩增片段长度为594by，扩增条件为:94℃30s,59.6℃30s,72℃30s,共35个循环，再72℃5min做终延伸。PCR产物进行琼肪糖凝胶电泳，结果采用凝胶成像系统进行分析，各组实验重复3次。
　　6.激光共聚焦显微镜检测DAB2蛋白表达:取对数生长期的}W480细胞接种于置有玻片的24孔板中，24b后用0}.,mol/L和10p,mol/L的药物按上述方式进行加药培养，72h取出细胞，依次多聚甲醛固定20min,10%山羊血清封闭1h，一抗4℃过夜，荧光二抗1h,PI染色5min，甘油封片，行激光共聚焦显微镜成像并数据分析，各组实验重复3次。
　　7.统计学方法:应用SPSS17.0统计软件分析，数据以均数士标准差表示，激光共聚焦数据采用独立样本t检验，其他行单因素方差分析。
　　结果
　　1.不同浓度5-Aza-CdR对SW480细胞凋亡的影响:以2.5,5.0,10.0}A,mol/L的5-Aza-CdR处理SW480细胞后，各组细胞凋亡率示:对照组凋亡率为(4.2710.33)%;2.5}.,t,mol/L组为(12.8910.59)%;5.0N.,mol/L组为(16.74士1.80)%;10.0Ex,mol/L为(33.0213.30)%。由此可见，不同浓度的5-Aza-CdR对SW480细胞的凋亡均有影响。随着5-Aza-CdR浓度的升高细胞凋亡率也逐渐增加。2.5,5.氏10.0}A,mol/L与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。
　　2.DAB2的甲基化状态(图1);DAB2}.基因BSP扩增片段包括22个CpG，DAB2克隆测序结果显示:随着5-Aza-CdR浓度的增加，CpG岛的甲基化程度逐渐降低。分别是:对照组为89.09%(98/110);2.5N.,mol/L组为70.00%(77/110);5:0}.,},mol/L组为55.45%(61/110);10.0}.},mol/L为10.91%(12/110)。
　　CpG甲基化的频率各组间差异均有统计学意义(p<0.O1)。
　　3.DAB2mRNA的表达:琼脂糖凝胶电泳结果显示各组可见灰度一致的594by的p-actin内参条带，并且均有297by的DAB2表达，与对照组比较，随着5-Aza-CdR的浓度逐渐增加，DAB2的灰度值也随之递增。以DAB2与p-actin的mRNA灰度值的比值反映目的基因DAB2表达量，空白组为0.26610.013;2.5},},mol/L组为0.36310.009;5.0p,mol/L组为0.49010.021;10.0N.:mol/L组为0.75310.028;各组与空白对照组差异有统计学意义(P<0.01，图2)。
　　4.激光共聚焦显微镜检测DAB2蛋白的表达:药物处理组和对照组均可见胞质、细胞核不同程度的分布绿色荧光，提示细胞质、细胞核中均有DAB2的表达。这表明DAB2在SW480细胞中存在一定程度的低表达(荧光强度为:94.50士13.39)，予以5-Aza-CdR处理之后DAB2的表达量增加(荧光强度为:123.7S士15.19)，实验组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。
　　讨论
　　基因启动子CPG岛甲基化将导致基因沉默、抑癌基因或其他功能基因的表达缺失「,a，既往对结直肠癌组织的研究显示，DAB2在结肠癌组织中呈现低表达状态，而在SW480细胞几乎不能检测到川，本实验结果显示DAB2在SW480细胞中可以少量检出。虽然DAB2在SW480中表现出很大程度的甲基化，但是并非完全，BSP测序结果表明其甲基化率为89.09%,RT-PCR和激光共聚焦显微镜均可以检出DAB2在细胞中的微量表达。S}X'480细胞在经过5-Aza-CdR处理之后，DAB2的甲基化水平降低，分别为70.00%,55.45%,10.91%，与对照组比较差异有统计学意义。
　　随着}-Aza-CdR对DAB2去甲基化作用的产生，DAB2的转录水平增高，DAB2蛋白表达升高，从而导致细胞凋亡，这种作用与对照组比较差异有统计学意义，同时还存在一定程度的剂量依赖性。本实验结果表明D-1B2可促进结肠癌细胞晚期凋亡。
　　本研究结果表明，在SW480细胞中，DAB2在胞质和胞核中共同表达，而既往研究结果显示，在肺磷状上皮细胞癌l，一、鼻咽癌、食道癌、膀胧移形上皮细胞癌中，DAB2蛋白主要表达于胞质，在胞核中几乎没有表达;而在肺腺癌中DAB2大部分位于胞核，细胞质中存在少量表达一5」以上研究结果表明DAB2的表达位置具有组织学特性，在磷癌、移形上皮癌中主要表达于细胞质，而在腺癌中DAB2共同表达于细胞质与细胞核。
　　DAB2是一种抑癌基因，在结肠癌组织及细胞中均是低表达状态。我们将5-Aaa-CdR作用于结肠癌SW480细胞后可见，5-Aza-CdR可以诱导结肠癌细胞凋亡，其机制与DAB2启动子CPG岛甲基化有关，并指出了DAB2表达位置与肿瘤的组织学类型相关。因此，DAB2在结肠癌中具有抑癌作用。
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