新型胰腺癌MUC1 DNA疫苗的免疫原性研究

胰腺癌MULL DNA疫苗有望诱导MUCl特异的抗肿瘤免疫应答，杀伤胰腺癌细胞，改善胰腺癌的预后。增强疫苗的免疫原性是构建胰腺癌治疗性DNA疫苗的关键。本研究拟在之前构建的VNTR DNA疫苗川基础上，进行优化构建新型MUCl DNA疫苗的免疫原性实验。

材料与方法

1.细胞株和抗体:Panc02,293T,EL4细胞株购自中科院生化细胞研究所，于DMEM(Gibco BRI、公司)液中培养(含IO%胎牛血清、2 mg/L青霉素、2 mg/L链霉素、2 mmol/L谷胺酞胺)。抗鼠MUCl单克隆抗体(ab10120)购自Abcam公司。抗HBV核心抗原单克隆抗体(MA1-90442，识别HBV核心抗原13 8-}-1}l 5位点)购自Thcrm。公司。抗鼠IL18单抗(sc-80043)购自Santa Cruz公司。

2.质粒构建:采用全基因合成的方法(吉尔生化上海有限公司)合成目的基因A(KOZAK-MCPl-3 V NTR,酶切位点为Nhc工和Sac I)将A片段插人真核表达载体pIRES2-EGFP.得到pIRES2-EGFP-KOZAK-MCP1一3VNTR(p工RES2-EGFP-A)，直接测序确认构建准确。之后.PC R扩增，连接获得目的基因B(IRES-C1-1=i4.酶切位点为Sac I和EcoR工)，插人真核表达载体p工RES2-EGFP-A，得到p工RES 2-EGFP-KOZAK-MCP 1 3VNTR一工RES-C1一144(P工RES2-EGFP-A-B)同法，体外连接获得目的基因C(工RES-mIL18.酶切位点为EcoR工一Sal工)，分别插人真核表达载体pIRES2-EGFP-A和pIRES2-EGFP-A-B.得到pIRES 2一EGFP一KDZAK一MCP 1一3VNTR一IRES-mIL18(pIRES2一EGFP-A-C)及pIRES2-EGFP-KOZAK-MCPl一3 VNTR-IRES-Cl一144-IRES-mI工18(pIRES2-EGFP-A-B-C>。转化平板挑阳性克隆，双酶切鉴定后，DNA测序确认。

3.免疫接种:C57BL/6J(H-2})雌性小鼠30只，6周，体质量15-29 g，购自复旦大学上海医学院动物实验中心。共分6组，每组J只小鼠:生理盐水组、pIRES2-EGFP空载体组、pIRES2-EGFP-3VNTR组、pIRES2-EGFP-3 VNTR-Cl一144组、pIRES2-EGFP-3 VNTR-mIL-18组、pIRES2-EGFP-3 VNTR-Cl-144-mIL-18组。用生理盐水将制备好的质粒DNA浓度调整为。.5 fig/户。采用小鼠双侧后腿胫前肌注射方法，每只小鼠注射质粒DNA 50}g/100川，每侧胫前肌注射50浏。腹腔注射100-}-150浏0.75%戊巴比妥钠溶液，麻醉C57BL/6组小鼠后用U-100胰岛素注射针完成注射。每2周加强免疫一次，共免疫3次。每次免疫前及处死小鼠前进行内毗静脉取血。

4.杀伤性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)杀伤实验:最后一次免疫结束后2周，拉颈处死小鼠。无菌取脾，制备细胞悬液，体外经VNTR合成肤刺激培养7d后备用。Calcein AM法检测其对E L-4 Muc,的特异性杀伤作用。

5.外周血抗体及细胞因子检测:抗MUCl抗体检测:取合成的VNTR多肤1}g，用PB缓冲液稀释1000倍，包被96孔板，每孔200}10 4 0C放置过夜。弃去封闭液，拍干，每孔加250浏PBS缓冲液，分别洗涤2次。每孔250尽的50aBSA封闭，洗涤。取小鼠待测血清，用生理盐水稀释100-50。倍，加人96孔板中，每孔100 u10 37 0C孵育1。弃去上清，拍干，每孔加250户PBS缓冲液，分别洗涤3次。加人HRP标记的抗小鼠址G的抗体(1:500稀释).3 7 0C孵育1 h。弃去上清，拍干，每孔加250月PBS缓冲液，分别洗涤3次。

按顺序加人显色液A,B和终止液各1滴。待颜色稳定后在酶标仪上侧定OD450。每个样品做3复孔，取平均值。采用IFN-y试剂盒(0与pIRES2-EGFP-3 VNTR组和pIRES2-EGFP-3 VNTR-Cl-144组相比.pIRES2-EGFP-3 VNTR-mIL-18组和pIRES2-EGFP-3 VNTR-Cl-144-mII=18组诱导产生的IF N-y水平更高，并具差异有统计学意义(PLO.05.图3)0讨论以胰腺癌肿瘤相关抗原MUCl为靶抗原构建肿瘤DNA疫苗免疫宿主后.可诱生MUC'1特异性CTL,可对携有靶点的术野残留胰腺癌细胞以及非手术区域亚临床转移的癌细胞进行有效攻击。我们在之前构建的VNTR DNA疫苗L基础f.进行了三方面的优化构建:C1)将重复序列VNTR的数目增至p个}'}:(2)插人乙型肝炎病毒核心抗原C1-1}1}编码基因困.(3)插人IL-I8基因。体外转染及Western blot检测证实各个优化构建的重组质粒均可在真核细胞中表达，。CTI、杀伤功能分析发现，优化构建的质粒免疫小鼠后，诱发的CTI_应答程度与优化构建策略数目相关。三重优化的p工RES2-EUFP-3VNTR-C1-144-mII.18组，其C'TI特异性杀伤率略高于双重优化组.p工RES2-EG FP-3 V NTR-Cl-144组和pIRES2-EGFP-3 V NTR-mII.18组。

而后两者的免疫原性又强于单重优化的pIRES2-EGFP-3 VNTR组结果表明，无论是Cl-1 14或者mI工,18，都可以通过一系列机制增强目的基因中靶抗原VNTR的加工和递呈，有利于宿主靶抗原V NTR的免疫识别，从而促进’I'HO向‘I'H 1细胞的分化，增强疫苗所诱发的免疫应答.从而增加新型疫苗的免疫原性本实验结果显示，各优化构建的重组质粒免疫小鼠后，均可诱导宿主产生抗ML一C1抗体。但各优化重组质粒间却没有显著差别。提示C'1-141或者mII=18对新型疫苗的免疫增强作用主要体现在对CT工、应答的促进作用上。而作为丁Hl免疫应答的关键细胞因子.I FN-y高低一也与CTL应答相关。本实验pIRES2-EGFP-3VNTR-mII=18组和pIRES2-EGFP-3VNTR-C1-144-mII.18组诱导产生的工FN-y水平显著高于pIRES2-EGFP-3 VNTR组和p工RES2-I?GFP-3 VNTR-Cl-144组。结果提示I工-18促进了THl应答.提高了工FN-y水平

参考文献

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