肝细胞癌中氨基肽酶N(CD13)的表达及其临床意义

肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一居恶性肿瘤的第五位。全世界每年新发肝癌患者约六十万，每年死于肝癌患者超过三十万二。肝癌治疗的总原则是早期发现早期治疗，强调实施规范化的综合治疗，但肝癌的复发率和死亡率仍然很高。近年来肝癌发生、发展、转移及预后相关基因已成为新的研究热点。CD 13又名氨基肤酶N(aminopeptidase N,APN)是一种11型膜结合锌离子金属蛋白酶，是一种可以将氨基酸从寡肤N末端切除的膜结合糖蛋白o

 CD13最早主要作为髓细胞表面标志物用于白血病分类的鉴别。近年来CD13在肿瘤方面的相关研究日益增多。研究表明其在体内通过单一机制或多个机制协同作用参与肿瘤病理生理过程。CD13通过蛋白水解酶的作用，降解细胞外基质，参与肿瘤间的信号传导，参与新生血管形成导致肿瘤的浸润和转移曰。本研究采用免疫组化方法研究了肝癌组织中CD13的表达情况，并分析其与临床病理学因素的关系，以期为肝癌的诊断、预后及靶向治疗提供依据。

资料与方法

1.一般资料:手术标本取自温州医学院附属第一医院2005年4月到2007年10月手术切除的有完整随访资料的55例肝细胞癌患者。所有患者术前均无放疗或化疗治疗史，并经病理组织学确诊。其中男47例，女8例，年龄24-}-78岁(中位年龄61岁)。HBsAg阳性50例，阴性5例。AFP阳性35例，阴性20例。肿瘤直径毛5 cm 21例，}5 cm 34例。肿瘤单发47例，多发8例。有肝硬化38例，无肝硬化17例。临床TNM分期工+11期22例，班+IZr期33例。WHO分级高分化8例，中分化22例，低分化25例。术中发现门静脉癌栓浸润者17例，未发现者38例。包膜侵犯13例，未侵犯42例。有淋巴结转移12例，无淋巴结转移43例。肝功能分级Child A级29例，Child B级26例。另取相应距癌肿2 cm以上癌旁肝组织、13例肝血管瘤旁正常肝组织作为对照。对检测的55例患者进行随访。生存期为患者接受手术之日起至死亡的时间。以至末次随访日(2012年10月)仍存活者生存时间定为截尾值，随访时间为J年。本研究经温州医学院附属第一医院伦理委员会批准，患者均知情同意。

2.免疫组化检测:CD13抗体、免疫组化试剂<2 metal-loproteinase)的过matrix(殊受体参与MMP子，也可间接调节肿瘤细胞增殖信号，或作为一种特降解细胞外基质，释放促进肿瘤细胞增殖的生长因机制主要有:(1)参与肿瘤细胞增殖:CD13可通过CD13与肿瘤的发生发展关系密切。具体作用讨论05，表3)。意义(均PGO.响总体生存率预后的独立危险因素，差异有统计学CD13表达、TNM分期、门脉癌栓相关，CD13是影因素COX逐步回归分析提示肝癌患者的预后与05)。多log-rank检验显示差异有统计学意义(PGO.3强阳性表达组(++)病例预后最差。组，其中CDl 3阴性表达CD13阳性表达组患者预后明显差于CDl 50个月。CD13阴性表达组中位生存时间为50.25个月，强阳性表达组(++)中位生存时间为9.75个月，CDl3阳性表达组(+)中位生存时间为14.K-M生存曲线分析(图3)显示CD13 o 05)(PGO.率均低于CD13表达阴性者，差异有统计学意义CD13表达阳性患者1,3,5年生存15)o

3.300<5 15),C11 73.30a<13 700生存率分别为86.40);CDl3阴性表达患者1年、3年、5年2.500<1 40)}C8 40),200o 020 5年生存率分别为50.00a 3表达阳性患者1年、3年、肝细胞癌组织中CDl 0D13在肝细胞癌中的表达与预后的关系:2.05，表2)0临床分期有关(PGO.与包膜侵犯、门静脉癌栓、淋巴结转移、肿瘤分级及能分级、肿瘤数目、是否有肝硬化表现无相关性，而Child肝功肿大小、年龄、性别、AFP大小、HBsAg,05，表1)。肝细胞癌中CD13蛋白表达与癌13)。三者表达差异具有统计学意义7.690a<1 55，正常肝组织中阳性表达率为12 C 0 81 21.55)，癌旁组织中阳性表达率为<40 73达率为72.CDl3在55例肝癌组织中阳性表(++)(图1}2)o胞膜，CD13阳性表达(+)和CD13强阳性表达特征的关系:癌组织中CD13的阳性表达主要在细0D13在肝细胞癌中的表达及其与临床病理1.结果05为差异有统计学意义。统计结果以PGO.log-rank检验。用COX回归模型进行预后相关性分阳性或阴性患者5年生存率。组间生存率比较采用分析。生存分析采用Kaplan-Meier方法计算CD13 3表达与相关临床病理因素的关系采用丫检验CDl 0统计分析软件.

4.统计学处理:采用SPSS 6分定为弱阳性表达，8}-12分定为强阳性表达。-}-4 3分定为阴性表达，<7600^-10000)。两者相乘。-}-1000);2分(11%一5000);3分(51%一7500);4分细胞的百分数评分为:0分(G50o);1分(5%一着色;1分浅黄色;2分棕黄色;3分棕褐色。按阳性半定量记分法根据免疫组化染色强度评分:0分无为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。采用在10X20倍显微镜下独立阅片，以预实验阳性片作达在细胞膜上呈现棕黄色颗粒。由两名病理科医生3.免疫组化结果判断:免疫组化CD13阳性表均以PBS代替一抗作为阴性对照。加DAB溶液显色，复染、脱水、封片，光镜下观察。min。滴冰箱过夜。滴加二抗，37℃保温箱孵育15 0C性过氧化物酶。微波抗原热修复后，滴加一抗，4 min阻断内源水化，用30oHzOz去离子水孵育10技术有限公司。

主要实验步骤:石蜡切片常规脱蜡、参与肿瘤新生血管的形成:新生血管形成有两个信号传导途径即Ras一丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)途径和Ras-PI3 K途径。CD13是Ras介导的两个信号传导途径的靶分子活化的Ras,Raf,MAPK传递信号到核内.使核转录因子Ets-2磷酸化。活化的Ets-2与CD13近端启动子相结合，启动转录6。(3)参与肿瘤细胞的局部侵袭和远处转移:CD13可水解靶器官或靶组织的细胞外基质、基底膜(基膜和W型胶原蛋白)。从而使原发灶的肿瘤细胞随血液或淋巴液循环迁移孰附形成转移灶。(4)降低机体免疫功能，导致肿瘤细胞存活:CDl3可通过降解IL-8,M工IC II型豁附抗原决定簇而降低T细胞对肿瘤细胞的识别了。近年的研究显示CDI3在肺癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤细胞表面均有异常表达而且与某些肿瘤的分化状态、临床分期和预后相关m但是对于CDl 3在肝癌中的表达及其与预后的关系，国内国外相关研究不多。

我们的研究显示肝癌组织CD13的阳性表达率高于癌旁组织以及正常肝组织，而且与门静脉癌栓形成、淋巴结转移、包膜侵犯，肿瘤的分级分期相关20世纪70年代，检测甲胎蛋白应用于临床，提升了肝癌的早期诊断率。但近年发现血清标志物AFP对早期患者的敏感性不甚令人满意.临床函需更加敏感或特异的血清标志物。Rocken等研究结论:CDl3在区分肝癌与非肝癌上比AFP更敏感。Van Hcnsbcrgcn等对一全血、良恶性胸腹水及肿瘤内液可溶性CD13(sCD13)水平进行研究表明:恶性肿瘤患者血浆或胸腹水中的sCD13的水平明显高于良性疾病患者。乳腺癌、卵巢癌和骨肉瘤患者体液中:CDl 3显著升高，提示sCDl3水平有助于恶性肿瘤的诊断日本Ikeda等yz}对50例胰腺癌患者研究显示，CDl 3与肿瘤新生血管有关，可作为胰腺癌的独立的诊断标志。CDl3有可能作为一个新的肝癌诊断标志物，但具体方法有待进一步研究。CD13与包膜侵犯、门静脉癌栓、淋巴结转移、肿瘤分级及临床分期有关，提示CD13与肝癌的浸润、转移关系密切，参与了肿瘤的发生发展过程。

CDl3阳性表达组病例的1年、3年、5年生存率显著低于CDl 3阴性表达组，CDl 3阳性表达组患者预后较差。C'()X分析显示CDl 3是影响肝癌患者预后的危险因素。这些结果提示CDl3的表达也可以作为判断预后的一项指标。目前.肝癌的主要治疗手段有切除手术和肝移植.还有经肝动脉栓塞化疗(TA(}E/TAE)以及经皮穿刺无水酒精注射(PEI>、射频消融(RFA)等非手术治疗方法。临床上多采用手术为主、药物为辅然而.肝癌确诊时大多已属中晚期.根治性切除率下降，术后并发症多且化疗药物毒副反应严重.应用化疗药物受限.以致远期疗效差。因此，寻找新的分子标志物诊断早期肝癌和寻找有效的基因靶点成为肝癌研究热点及难点。CD13对于早期肝癌的诊断及其有效治疗具有潜在应用前景。研究表明CD13抑制剂可通过半肌天冬酶3信号途径和磷脂酚肌醇3激酶(PI3K)一糖原合酶(GSK)信号途径诱导K562细胞和急性白血病细胞U937凋亡岛。其代表药物为Bestatin，是一种从橄榄网状链霉菌培养液发现的小分子肤。目前，CDl 3抑制剂已用于动物肿瘤转移模型的治疗，已有多种药物在人类临床前实验中取得良好的抗肿瘤效果。Tsnkamoto等的研究表明Bestatin能提高宫颈癌化疗疗效，诱导宫颈癌细胞Hela凋亡。Christ等研究发现Bestatin能诱导肝癌细胞凋亡，提高肝癌化疗疗效。NGR血管跟踪肤即天冬氨酸一甘氨酸一精氨酸(Asn-GIy-Ar妇是CD13的特异性受体。以NGR为载体.将各种抑癌物质如阿霉素、肿瘤坏死因子和抑癌基因特异结合研究肿瘤血管靶向治疗新药物，可增加疗效，减少全身用药，降低不良反应。Chen等将包裹阿霉素的脂质体和抑癌基因与VGR结合靶向导人C D13阳性表达的人纤维肉瘤细胞Ht-1080,引起CDl 3表达阳性的hT-1080细胞凋亡。然而CD13在人体分布范围广、功能多，参与各种生理病理过程。因此，只有研制出选择性高、组织特异性好的CD13靶点药物才可有效抗肿瘤，否则会影响机体功能，产生多种并发症。综上所述.CD13的检测对肝癌的诊断、预后及治疗具有一定的临床应用价值。

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