caspase蛋白在肝脏缺血再灌注损伤中的研究进展

　　以往认为,肝脏的缺血再灌注损伤(Ischemia~reperfll蚯cln而ury,IRI)引起的肝脏损伤主要表现为肝细胞坏死。近年的研究表明,在肝脏IRI时,除存在肝细胞坏死外,还存在肝细胞凋亡。肝脏遭受IRI后,肝组织受损不仅来自IRI的直接作用,而且由于凋亡机制的启动与放大造成肝细胞死亡并进而参与肝组织损伤。因此,如何减轻肝脏IRI后发生的肝细胞凋亡也具有重要的预防和治疗意义。caspase家族在细胞凋亡的研究领域中占有重要的地位[l],它是多条凋亡通路的汇聚点,是执行凋亡的最终途径,如Bcl-2家族、FAS、TN⒎a等介导的细胞凋亡,最终都通过调节caspase蛋白来实现。因此现就近几年来caspasc蛋白在肝脏IRI实验领域中的研究进展作一综述。
　　1caspase家族及其简要功能和调控机制
　　caspase家族是一类具有特异天冬氨酸的半胱氨酸蛋白酶,它们的结构相似,通常情况下,以无活性的酶原形式存在于细跑中。酶原分子由三部分组成,包括工个N端前域及一大一小两个亚基。酶原分子激活后,大小亚基解离并重新组装为四聚体形式的活性酶。由于caspase蛋白可自我活化并能相互激活,因此凋亡过程一旦触发,即呈级联放大效应。根据caspase蛋白在级联反应上下游的位置和功能的不同,可分为三大类:第一类为凋亡始动子,位于级联反应上游,包括caspase-2、8、9、10等,能在其他蛋白参与下发生自我活化并激活下游的caspase蛋白;第二类为凋亡效应子,位于级联反应下游,包括caspase-3、6、7,能被上游的始动子激活,激活后的caspase蛋白作用于特异性底物,如PARP等,使细胞发生生化及形态学改变,导致细胞凋亡;第三类包括caspasc-1、4、5、13、14,主要参与细胞因子介导的炎症反应并在死亡受体介导的细胞凋亡途径中起辅助作用。
　　目前已发现14种caspase蛋白,除caspase-11、12、13外,其余均在人类细胞中表达。在细胞凋亡过程中,caspaqe-3是主要的效应者分子之一,一旦被激活凋亡就不可避免,因而cc·sp灬e-3被称为“死亡蛋白酶”。正常情况下,细胞质中的ca叩clse-3以无活性的酶原形式存在,细胞凋亡信号的出现可导致caspase-3在多种蛋白水解酶的作用下,发生裂解而活化。
　　caspase-3介导的细胞凋亡有两条主要途径:细胞外途径和细胞内途径。细胞外途径是通过配体与细胞膜上的死亡受体结合,形成死亡启动信号复合物,致caslDase-8活化,并激活下游的ωsp洮e3等发挥作用c细胞内途径指各种因素致线粒体外膜通透性增加,细胞色素C等释放,与凋亡相关因子(Apoptosis-dat-eflhctors-1,APAF-I)形成凋亡小体,激活caspasc-9及其下游的caspa陡-3等,使细胞凋亡。
　　此外还有内质网介导的凋亡通路,此通路在人类中主要由caspaq4介导,在鼠类中主要由cas介导。当大量蛋白在内质网错误折叠使内质网产生应激时,内质网会减少蛋白的继续加工,同时上调某些蛋白的表达来处理已经产生的错误蛋白,这个过程就是未折叠蛋白反应。sp“e-12介导的细胞凋亡主要通过内质网中被激活的未折叠蛋白反应来实现[3]。
　　另外,还有钙离子信号机制,细胞损伤后内质网释放钙离子,激活钙蛋白酶,钙蛋白酶能切割lDr。caspase12,形成并激活caqp,被激活的m哪e~12从内质网进入到细胞液中作用于caspase-9,激活caspase-3,最终引起细胞凋亡。
　　2实验性肝脏IRI损伤模型的建立和caspase蛋白的变化实验性肝脏IRI是一种常见的病理生理过程,在肝肿瘤行广泛肝叶切除时阻断人肝血流、肝移植等均涉及IRI。
　　目前,肝脏IRI后的细胞凋亡实验研究较为引人关注。尽管实验模型各不相同,但许多研究都是通过对模型中caspase蛋白的检测反映细胞凋亡的程度的。在众多的研究模型中,部分模型的应用较为广泛和成熟,如MendcsBraz等「4∶在文献中描述了大鼠部分肝脏IRI模型的建立,即在分离肝十二指肠韧带后,用无损伤血管夹夹闭通往肝中、肝左叶的血管和胆管,致70%的肝脏缺血,然后于不同缺血时间去夹恢复血流即为再灌注。还有几种方法可制作常温下的肝缺血模型,如p⒒吧le法、叩lccl△lDcaⅤal分流、por~哂u驷h分流、脾换位法等,目前已较少用。
　　肝移植模型研究方面,自Kamada和Cdne[5]在1983年报道二袖套法大鼠原位肝移植手术模型以来,该模型在肝胆外科研究领域应用广泛,是经典的大鼠原位肝移植模型之一。由于该模型操作复杂,学习时间较长,目前大多用改良的方法建立模型。如罗刚健等:6]报道了改良的大鼠原位肝移植模型,技术要点有:肝上下腔静脉的阻断,可采用活结结扎取代动脉夹,肝上下腔静脉结扎的活结处垫一块脑棉片以防结扎和松结时损伤下腔和膈静脉等,手术成功率明显提高。严佶祺等7∶报道了50%及30%大鼠部分肝移植模型的建立,认为减少游离肝脏时的机械损伤、细致的供肝修整、提高吻合口质量、缩短无肝期和下腔静脉阻断时间以及注重受体大鼠体温的恢复是大鼠部分肝移植模型成功的关键。在各种实验模型基础上,检测肝组织IRI后∞spase蛋白表达,如caspase-3、8、9等,常常较对照组明显提高,反映肝细胞凋亡。
　　3caspase蛋白在肝脏IRI中的作用
　　3.1caspase蛋白的表达
　　在肝脏IRI中,各种因素通过前面介绍的3种凋亡途径诱导caspase蛋白表达,执行细胞凋亡。
　　caspasc蛋白诱导的肝细胞凋亡无炎症反应参与,这有利于肝细胞板的重塑。这个重塑过程不仅依赖于细胞再生和凋亡的程度,也取决于细胞凋亡和清除过程的匹配。在肝移植中,最初的肝细胞损伤出现在低温保存过程中,再灌注时,累积的代谢产物的快速代谢导致有毒分子的产生,例如自由基等,并激活细胞凋亡。缺血本身可以触发细胞凋亡,但再灌注加速这一过程。用荧光显微镜,能够确定ca叩ase蛋白活性,特别是在血管周围区域的再灌注的肝细胞中。
　　在肝移植过程中一组参与细胞凋亡的调控基因,即移植肝初期肝功能不良(I而而lpoorgaflfttllction,IPGF)调控基因高表达,同时移植的肝细胞中caspase活性增加。
　　3.2多种预处理对caspase蛋白表达的影响
　　IRI前的多种预处理方法可对caspac,e蛋白的表达产生影响。比如:Cllen等[l’∶研究发现,人热休克蛋白27(HS”7)对小鼠肝IRI有保护作用,肝细胞凋亡减轻,肝功能好转,其机制之一就是HS”7可通过凡s与Fas配体导致caspasc-3下调进而使肝细胞DNA和聚腺苷二磷酸一核糖多聚酶裂解减少c%toh等ⅡJ发现,在大鼠原位肝移植模型中,包含末端转移酶标记技术检测呈阳性的细胞核的肝细胞团,无caspase-3、mspasc-7活性,能减轻肝功能损害和受体大鼠病死率。
　　Wang等在大鼠自体原位肝移植模型中发现氯化钆能够减轻胆管细胞在热IRI时的早期凋亡,这种作用与Fas-FdsL途径的抑制和ωspase-3的表达下调有关。
　　该实验证明了氯化钆对肝移植早期热IRI的大鼠胆管细胞有保护作用。⒗reeⅤ等[:]通过制造高脂血症大鼠肝脏中间叶和左外叶的IRI模型,发现褪黑激素能减少促凋亡基因的表达,同时也抑制由于cc△spc△∞-9的激活而引发细胞内凋亡途径,从而保护脂肪肝细胞的IRI。
　　另外,Yang等[14]通过大鼠肝脏⒛%IRI模型研究,索拉非尼对非酒精性脂肪肝IRI有保护作用,这一作用是通过Rho激酶依赖途径介导的,实验中发现索拉非尼预处理组,缺血肝组织再灌注后血流动力学改善明显,肝脏血运快速重建,检测肝组织caspasc-3、9表达下调,肝细胞凋亡减轻。Uc·hidd等b∶研究发现,使用部分肝脏热IRI损伤建立的小鼠模型可观察到中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂(NeutR)l·hilclaqtaⅡhhibi-br,NEI)预处理后,ωsloctse-3活性下降,肝细胞凋亡减轻。这一过程可能与NEI下调TLPL0及其下游的CX-C⒈10表达有关。Wnt/[βJ-连环蛋白信号转导通路在肝脏发育,再生和凋亡的平衡中起着至关重要的作用。
　　ICtlnce诵tcla等[№]通过肝脏TO%IRI损伤模型发现,Wnt信号激动剂[2-氨基-4-(3,⒋亚甲二氧基苄基氨基)-⒍(3-甲氧基苯基)嘧啶]可显著降低cascasc-3活性水平,减轻肝细胞凋亡。另有实验表明[田],一种新型的不可逆的广谱⑾spasc蛋白抑制剂的使用,如IIlN-b~s56、Z-ⅤAD-FMK、Z-ASP-CMK等,能有效减轻肝脏IRI。
　　4caspase蛋白在肝脏IRI研究领域及临床应用中的前景各种脏器组织在发生IRI时都会出现细胞凋亡,且在局部发生IRI时除了局部脏器细胞发生凋亡外,还可以引起远隔器官细胞凋亡。早在⒛世纪末,Kc山等[1:]研究发现,在肢体发生IRI期间,肠上皮细胞也会发生异常凋亡;他们进一步研究发现,肢体IRI期间,肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平升高,上调Fas蛋白的表达,通过活化casp洮e-3,最终导致肠上皮细胞发生异常凋亡。在IRI导致肝细胞凋亡的同时,邻近的肠道组织、胰腺组织乃至脾脏等组织均可能发生异常的细胞凋亡,Dello等[J9:通过对z例部分肝切除的患者研究发现,间歇性或者完全性p五ngle法阻断肝门可能引起肠上皮细胞的损伤和内毒素血症,甚至可能引起全身炎症反应综合征,但具体机制仍不明确,故在今后的实验研究中也可对细胞凋亡相关环节,如caspc牧蛋白等进行检测,以利于更好地减轻由肝脏IPLI带给机体的一系列凋亡损伤。
　　caspase蛋白在临床医学其他领域的应用也在不断探索中,如HER2阳性的癌症代表了一类具有高转移性,预后差的恶性肿瘤。在胃癌治疗的研究中,Rcn等[201合成了一种重组蛋白质夕3sFlr-FDT-CAS跖,其中包含一个抗HER2的单链抗体(e23sFv)、白喉毒素(FDT)及活化的casp洮e-6,这种蛋白在HER2阳性的胃癌细胞中,通过受体介导的内吞作用,并在内涵体中通过ftlrin介导的裂解作用,最后释放出C-末端片段(有活性的caspase6),而不通过跨高尔基体及内质网途径。活化的caspase6通过裂解基板及核纤层蛋白A等作用,最终引发肿瘤细胞凋亡。此外,阈3sFlT-FDT~CAS%蛋白对以HER2表达下调为特征的曲妥珠单抗耐药的胃癌细胞有毒性作用,因此,塑3sFxr~FDT-CASP6重组蛋白为HER2阳性和曲妥珠单抗耐药的胃癌提供了一个很有前途的治疗选择。
　　另外,小胶质细胞的激活及炎症介导的神经毒性被认为在一些神经退行性疾病的发病机制中发挥了决定性作用。激活的小胶质细胞释放炎症因子,可能具有神经毒性。Burguillos等发现,有序活化的caspase-8和caspase3、7可通过蛋白激酶C依赖的途径调节小胶质细胞活性,因而可通过抑制caspase蛋白的表达,阻碍小胶质细胞活化,减轻神经毒性。
　　这一研究可能为帕金森病的治疗提供新的思路。总之,caspasc蛋白作为目前在细胞凋亡实验中应用广泛的指标,可能会在肝脏IRI领域和其他学科的临床应用中展现出更为广阔的研究前景。
　　参考文献
　　Ola MS,Nawaz M,Ahsan H. Role of Bcl-2 family proteins and caspases in the regulation of apoptosis[J].Molecular and Cellular Biochemistry,201 ,(1/2):41-58.
　　Favaloro B,Allocati N,Graziano V. Role of apoptosis in disease[J].Aqing (Albany NY),2012,(05):330-349.
　　Moserova I,Kralova J. Role of ER stress response in photodynamic therapy:ROS generated in different subcellular compartments trigger diverse cell death pathways[J].PLoS One,2012,(03):e32972.
　　Mendes-Braz M,Elias-Miró M,Jiménez-Castro MB. The current state of knowledge of hepatic ischemia-reperfusion injury based on its study in experimental models[J].Journal of Biomedicine and Biotechnology,2012.298657.
　　Kamada N,Calne RY. A surgical experience with five hundred thirty liver transplants in the rat[J].Surgery,1983,(01):64-69.
　　罗刚健,赵伟成,朱国松. 大鼠自体肝移植模型的改良——附216例分析[J].实用医学杂志,2012,(10):1605-1607.doi:10.3969/j.issn.1006-5725.2012.10.010.
　　严佶祺,张明钧,杜志勇. 大鼠部分肝移植模型建立的技术要点[J].肝胆外科杂志,2010,(03):217-219.doi:10.3969/j.issn.1006-4761.2010.03.024.
　　Cursio R,Colosetti P,Auberger P. Liver apoptosis following normothermic ischemia-reperfusion:in vivo evaluation of caspase activity by FLIVO assay in rats[J].Transplantation Proceedings,2008,(06):2038-2041.
　　Cursio R. Caspase inhibition in liver transplantation:from basic research to clinical studies[J].HPB(Oxford),2010,(01):1-3.
　　Chen SW,Park SW,Kim M. Human heat shock protein 27 overexpressing mice are protected against hepatic ischemia andreperfusion injury[J].Transplantation,2009,(10):1478-1487.