谷氨酰胺诱导热休克蛋白70高表达可抑制大鼠心房肌纤维化及缝隙连接蛋白43重构

心房颤动(房颤)是临床上最常见的心律失常,致残率和致死率均很高,房颤的发病机制一直是医学研究的热点研究发现心房重构,即电重构和结构重构在房颤的发生、维持以及复发中都起到关键的作用.在心房结构重构的研究中发现,心房纤维化和心肌缝隙连接蛋I勺(connexin,Cx)重构是心房结构重构的重要表现形式3",有研究指出Cx基因治疗可预防房颤s,两者在房颤的发生和维持中的作用已成为人们关注的焦点有多项研究表明房颤时伴有肾素—血管紧张素系统(RAS)的激活,Itiii亥系统的激活对其发生、维持及其心房肌重构起着重要作用，"RAS中的主要效应分子—III管紧张素且(Ang11),可通过与Ang}的I型受体(ATIR)结合激活妊裂原活化蛋自激酶家族(mitogen-activatedproteinkinases,MAI'K)rf的C-Jun氨基末端激酶(JNK)通路,诱导产生多种生物细胞学效应,如炎症、细胞凋亡、生长及分化等7一9,并有研究指出该通路的激活参与了心房纤维化""并可减少心肌Cx43的表达，另有研究发现热体克蛋自70(Hsp70),一对JNK通路中的关键激酶-JNK产生抑制作用,使磷酸化及C一Jun蛋自表达减少,从Ifi阻断JNK信号通路介导的生物学效应,但Hsp70表达升高是否可通过抑制lNK信号通路改善心房肌纤维化程度及Cx43重构,尚末见相关报道以往的研究多以热应激处理的方式诱`,-Hsp70表达升高,该方法具有一定的局限性,临床土难以推广应用近期有研究发现谷氨酞胺(glutaniine,Gln)诱导FIsp70表达,但由于Gln溶解度低、性质不稳定,不易于研究运用而丙氨酞谷氨酞胺(Ala-Gln)已广泛用于肠外营养支持治疗,具有肯定的安全性和有效性,巨已有研究表明Ala无论在动物还是人体内对Hsp70的表达影响均不明显’6’7,故本研究选择Ala-Gln作为Gln的供体诱份Hsp70表达,参考Zhang等方法采用皮下多点注射大剂量盐酸异丙肾I_腺素(isoprenaline,1S0)诱导大鼠心房f1JL纤维化模型,观察Gln诱导的Hsp70高表达对心房肌纤维化和Cx43重构的影响并探讨其机制.
    材料与方法
    1.实验分组及动物模型的建立:SPF级雄性SD大鼠40只,体质量为(180士20)g,购自甘肃省中医学院实验动物中心.随机数字表法随机等分为对照组、DMSO组、ISO5mg·kg·d组(模型组)、ISO5mg·kg·d+Ala-Gln0.75mg·kg-'g·d组(干预组)和ISO5mg·kg·d+QUE100mg·kg·d+Ala-Gln0.75mg·kg·d+DMSO组(QUE组)5组.模型组、干预组和QUE组大鼠按5mg/kg体质量腹部皮下多点注射ISO购自上海禾丰制药有限公司),1次/d;十预组于ISO注射前60min按0.75m剔kg体质量给予Ala-Gln溶液(Ala-Gln+0.9%NaCI配成浓度为3.3%的溶液)腹腔注射(Ala-Gln购自海南灵康制药有限公司)1次//d;QUE组在给予Ala-Gln溶液前6h,按100ill剔kg体质量给予棚皮素(热体克蛋白抑制剂)腹腔注射(购自美国Sigma公司),使用时溶解于DMSO中(上海碧云天生物技术有限公司),1次/d;对照组大鼠分别在相应时间内皮下和腹腔注射与模型组、干预组、QUE组等量的生理盐水DMSO组分别在相应时间内腹部皮下注射和腹腔注射与模型组、干预组等量的生理盐水,且腹腔注射与QUE组等量的DMSO.大鼠心房纤维化模型的鉴定采用HE染色法,而且经过预实验鉴定结果证实此种造模方法可取,40只SD大鼠均完成整个实验过程.
    2.取材及标本保存:各组大鼠按上述方案连续给药至第7d时处死.沿心脏长轴剪开大鼠心脏,暴露心腔并取部分心房组织置于中性甲醛液中固定24h,经石蜡包埋后,连续切片6张,每张厚3p,m,2张分别用于苏木素伊红(HE)染色和Masson染色,其余4张用免疫组织化学法半定量检测心肌组织中Hsp70,p-JNK1/2/3,c-Jun及Cx43含量.剩余心脏组织取出后立即放人冻存管中并置一80℃冰箱中冷冻保存,用于检测心肌组织中Ang}I的含量.
    3.放射免疫法检测大鼠心肌组织中AngII含量:取一80℃冰箱中冻存的心肌组织各100mg,按碘}I_SI}AngII放射免疫分析试剂盒(购自北京北方生物技术研究所)说明书要求加人2种酶抑制剂(8}A,10.32mol/L二琉基丙醇和17N.,10.34mol/L8_轻基唆琳硫酸盐),玻璃匀浆器低温条件下研磨(冰水浴中进行),后加人1ml0.01mol/LPBS液(pH值7.4)稀释,离心机3580g,4℃离心15min,取上清液500p,1检测AngII浓度(pg/L).
    4.大鼠心肌组织病理改变及心肌胶原容积分数(collagenvolumefraction,CVF)的计算:心肌石蜡组织切片常规HE染色,光镜400倍下观察心房肌纤维化及心肌细胞排列情况并摄片,Masson染色后每张切片选取4个不重叠无血管视野(x400)拍照,运用Image-Proplus5.0图像扫描软件进行图像分析,计算CVF,CVF(%)=胶原面积/全视野面积x100%.
    5.免疫组织化学SP法检测大鼠心肌组织中Hsp70,p-JNK1/2/3,c-Jun及Cx43的含量:将心肌组织切片置于68℃烤箱60min,常规脱蜡至水;蒸馏水冲洗3minx3次;PBS缓冲液(pH值为7.2-7.4,主要由NaCl137mmol/L,KCl2.7mmol/L,Na}HPO}10mmol/L和KH=P0,2mmol/L组成)中浸泡15min;高压锅抗原修复;蒸馏水冲洗3minx3次;3%H,O,去离子水370C孵育15min;PBS冲洗3minx3次;正常羊血清工作液封闭,37℃孵育15min,倾去勿洗;滴加1:100兔抗鼠一抗工作液(分别为p-JNK1/2/3,Hsp70,c-Jun及Cx43抗体,均购自北京博奥森生物技术有限公司)37℃孵育2.5:(并用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照);PBS冲洗3minx3次;滴加生物素标记二抗(SP试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司),370C孵育20min,PBS冲洗3minx3次;然后滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液,370C孵育20min,PBS冲洗3minx3次;室温下DAB显色(DAB显色试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司),镜下控制显色时间;自来水充分冲洗;复染;脱水;透明;中性树脂封片;镜检.每张切片中各取4个非重叠无血管视野(x400),利用Image-Proplus5.0图像扫描软件进行图像分析,测定每个视野下阳性物质的平均光密度值(meandensity),meandensity=累积光密度值(IODSUM)/面积(area).
    6.统计学分析:所有数据均以表示,采用SPSS13.0软件进行统计分析,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法,相关性分析采用Pearson相关性检验,以P<0.05为差异有统计学意义.
    结果
    1.各组大鼠心房肌组织中AngII含量的检测结果:各组大鼠心房肌组织中AngII的含量由低到高依次为对照组〔(68.51士10.76)pg/L],DMSO组[(71.47士11.49)p群L]、干预组[(185.32士54.85)pg/L],QUE[(189.90士42.12)pg/L」和模型组[(211.25士49.49)p岁],其中DMSO组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),其余各组均显著高于对照组和DMSO组(P均<0.O1),而模型组、干预组和QUE组间比较差异均无统计学意义(P均>0.O5).
    2.各组大鼠心房肌组织病理改变及CVF检测结果:(1)HE染色结果(图1):对照组和DMSO组大鼠心房肌纤维清晰、排列规则、无明显纤维化,而模型组、QUE组肌纤维排列紊乱、细胞外间隙增宽,部分心房肌纤维扭曲肿胀、肌浆溶解、纤维断裂,纤维化明显,而干预组则较模型组心房肌纤维清晰,排列相对规则,纤维化较轻.(2)Masson染色结果和CVF计算结果(图2):CVF由低到高依次为对照组[(6.84211.674)%〕、DMSO组「(7.10811.343)%}、干预组[(7.86111.867)%},QUE组[(25.06018.581)%」和模型组[(29.48519.966)%},其中对照组和DMSO组无心房肌纤维化,干预组CVF与以上两组比较差异无统计学意义(P均>0.O1),且明显低于QUE组和模型组(P均<0.O1).
    3.各组大鼠心房肌组织中Hsp70,p-JNKl/2/3,c-Jun及Cx43的免疫组织化学染色半定量结果:(1)各组大鼠心房肌组织中Hsp70的含量(图3),各组大鼠心房肌组织Hsp70半定量分析结果示对照组(0.160士0.023),DMSO组(0.163士0.022)、模型组(o.166土0.028)、QUE组(0.168士0.027)HsP0含量差异均无统计学意义(P均>0.05),干预组(0.215士0.018)较其他各组高(P均<0.O1).(2)各组大鼠心房肌组织中p-JNK1/2/3和c-Jun的含量:各组大鼠心房肌组织中p-JNKI/2/3和c-Jun半定量分析结果示DMSO组(分别为0.154士0.021和0.164士0.024)与对照组(分别为0.151士0.016和0.163士0.022)比较差异均无统计学意义(P均>0.05);模型组(分别为0.202士0.025和0.254土0.044),QUE组(分别为0.196士0.024和0.251士0.027)均较对照组和DMSO组高(P均<0.01);干预组(分别为0.160士0.025和0.168士0.024)与对照组和DMSO组比较差异均无统计学意义(P均>0.05),而较模型组、QUE组含量低(P均<0.01)0(3)各组大鼠心房肌组织中Cx43的分布及含量(图4):对照组、DMSO组和干预组大鼠Cx43线性规律分布于心肌细胞闰盘处,仅少量分布于心肌细胞侧面,而模型组、QUE组Cx43分布无规律且侧面分布相对增加.各组大鼠心房肌组织中Cx43含量半定量分析结果显示DMSO组(0.220士0.032)与对照组(0.231士0.035)比较差异无统计学意义(P>0.O5);模型组(0.163士0.013),QUE组(0.165士0.024)均较对照组和DMSO组低(P均<0.O1);干预组(0.216士0.026)与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),且干预组显著高于模型组(P<0.O1).
    4.Hsp70,p-JNKl/2/3,c-Jun及CVF的相关性分析:Pearson积差相关性分析示心房肌组织中Hsp70含量与p-JNK1/2/3,c-Jun含量及CVF呈负相关关系(分别为r=一0.566,P<O.OI;r=-0.683,P<O.Ol;r=一0.466,P<0.O1),而与Cx43含量呈正相关(P<0.O1).p-JNKl/2/3和c-Jun的含量与心房肌纤维化程度呈正相关(分别为r=0.881,P<O.Ol;r=0.862,P<0.01),而与Cx43含量呈负相关(分别为r=一0.891,P<0.O1;:=一0.788,P<0.O1).
    讨论
    许多研究证实RAS系统的激活参与房颤时心房肌纤维化及Cx重构,对房颤的发生及维持起着重要作用.该系统中的主要效应分子Ang}可通过与细胞G蛋白偶联的ATl受体结合激活MARK中JNK通路,产生多种生物学效应,如细胞增殖、分化、凋亡等「6一91.已有研究表明JNK通路激活参与房颤时心房肌纤维化并可调控心肌细胞Cx的表达.因此JNK通路的激活可能与Ang}诱发的心房肌纤维化及Cx重构关系密切.
    缝隙连接(gapjunction,GJ)是相邻心肌细胞间电和化学信号传递的通道,可使电兴奋在相邻心肌细胞间有序传导,使心肌收缩同步化,从而提高心脏泵血效率.在一些情况下GJ可发生重构,GJ重构易引发功能紊乱,导致心律失常’a_心肌GJ中的结构蛋白主要有Cx40,Cx43和Cx45,而Cx43作为心房中主要的连接蛋白,大部分呈线状分布于闰盘部位,心肌细胞膜侧面分布极少Cx43表达量减少、非均匀化及侧面化,即Cx43重构是心房结构重构的重要因素.Cx43表达量的减少及非均匀化RJ改变电传导的同向性,使电传导速率降低,且易形成折返,造成心律失常一而GJ的侧面化,可使Cx43形成的半通道增多,可导致Na十内流和、TP外流,引起延迟后去极化「zn,病理条件下心肌Cx43的这些重构,是构成心律失常的基础之一Hsp是细胞在应激原刺激作用下合成的一组蛋白质,以分子伴侣形式直接作用于蛋白分子,通过影响细胞信号途径发挥抗应激和细胞保护作用,其中Hsp70作为Hsp家族中重要组成部分,在生物细胞中含量最高,可诱导性最强,具有保护细胞免受刺激损伤,促进受损细胞修复及抗炎、抗凋亡、耐受缺血/缺氧损伤等多种生物学功能其升高对冠心病、心肌缺血/再灌注损伤一24、心肌缺血预适应等心血管疾病具有保护作用.St等ze和Mandal等〔z}研究了接受冠状动脉旁路移植术的患者心房组织中Hsp70的表达水平,显示Hsp70表达水平较高的患者,术后房颤发生率较低,具体机制尚未完全清楚.
    本实验中大鼠大剂量皮下注射ISO7d后发现,模型组、干预组、QUI;组心房肌组织中AngII含量较对照组和DMSO组高,且模型组心房肌纤维化明显,Cx43表达量减少、出现非均匀化及侧面化,p-JNK1/2/3和c-Jun的表达也较对照组高,表明注射ISO后RAS启动,心房肌组织Ang11含量升高并激活JNK信号通路,参与了大鼠心房肌纤维化和Cx43重构.干预组以Ala-Gln作为Gln的供体,腹腔注射后可诱导心肌组织特异性表达Hsp70,使心肌纤维化和Cx43重构减轻,而p-JNK1/2/3和c-Jun的表达减少,提示谷氨酞胺对Ang诱发的心房肌纤维化和Cx43重构具有保护作用且与抑制JNK信号通路有关.进一步研究发现QUE组使用了Hsp70抑制剂后可抑制心房肌组织中Hsp70的表达,同时p-JNKI/2/3和c-Jun的表达水平升高,心房肌纤维化程度和Cx43重构明显,与模型组比较无明显差别,表明Ala-Gln对ISO诱发的心房肌纤维化和Cx重构的保护作用主要是通过诱导心肌组织Hsp70表达、抑制JNK信号通路实现的,抑制了Hsp70的表达,这种保护作用也随之消失.
    综上所述,Ala-Gln可通过诱导心肌组织中Hsp70的表达起到延缓ISO引起的大鼠心房肌纤维化和Cx43重构的作用,机制可能与下调p-JNKI/2/3及c-Jun的表达,抑制JNK信号通路,从而抑制该通路介导的细胞凋亡、增殖、分化等有关.Ala-Gln作为Gln的供体,已广泛用于肠外营养支持治疗,具有肯定的安全性和有效性,故Ala-Gln诱导Hsp70升高、用于预防或改善房颤患者心房肌纤维化和Cx43重构具有临床应用价值.
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