心肌组织工程补片对心肌梗死大鼠心室肌电活动及自主神经重构的影响

　　心肌梗死(简称心梗)后梗死周边区的去神经支配和随后发生的自主神经再生使心脏自主神经发生不均一重构，从而有利于室性心律失常基质的形成。大量研究证实交感张力增加可诱发室性心律失常21，有室性心律失常病史患者的心脏交感神经密度显著高于无此病史者「3]。组织工程是一门正在迅速发展的学科，它的目标是结合细胞、生物材料和生物活性分子来制造、修复甚至替代组织和器官。心肌组织工程是组织工程研究领域的热点之一。笔者应用电生理技术和免疫组化技术探讨大鼠心梗后心脏局部自主神经重构及电生理的改变，以及心肌组织工程补片对心梗大鼠心室肌电活动及自主神经重构的影响.
　　材料与方法.
　　1.1实验动物及分组①成年SD大鼠45只，体重在220一250g左右，雌雄不拘。随机分为3组:假手术组、心梗组、移植组。每组巧只。假手术组及心梗组大鼠由新疆医科大学动物实验中心提供，动物质量属于一级标准。移植组动物模型由军事医学科学院动物中心提供。②新生1一2d的Wista:大鼠100只，用于心肌细胞的分离，由军事医学利一学院动物中心提供，动物质量属于一级标准.
　　1.2心梗模型制作采用10%水合氯醛溶液(0.3ml/100mg,ip)麻醉成年SD大鼠，仰卧固定于实验台上，沿胸骨正中开胸，剪开心包，充分暴露心脏，在左心耳至心尖的1/2处以5/0号无菌缝线结扎前降支，以LEAD2007电生理仪的心电导联连接大鼠的四肢之后，记录心电图II导联ST段持续抬高0.1mV作为手术成功的标志。假手术组只进行麻醉和开胸及剪开心包，不结扎前降支。心梗组与移植组均行心梗模型制作。
　　1.3主要试剂、溶液成分和仪器改良台式液成分(mmol/L):NaCI144,KCl5.0,CaCl21.8、MgC1Z1,1VaH2POQ0.33,glu-corelO,HEPESS.O,pH7.4}DMEM(美国Sigma公司)，胎牛血清(北京元亨圣马生物技术研究所)，胰酶(美国Sigma公司)，鸡胚抽提物(自制)，基底膜基质(Matrigel，美国Sigma公司)。COZ培养箱，心肌细胞/胶原复合物铸膜装置。
　　1.4实验方法①I型胶原的制备I型胶原参照文献制备。从SD大鼠尾根部切断鼠尾，置于75%的酒精中浸泡30min;无菌条件下撕下尾键，剪碎。取1.5g尾腿碎片浸人150ml0.1%的醋酸中，置4℃冰箱，用磁力搅拌机进行搅拌。48h后离心收集上清即得胶原溶液。制备的胶原溶液用电子天平称出其中所含的胶原量约为1.9mg/ml}②心肌细胞的分离「5:新生1一2d的SD大鼠100只，于75%酒精中浸泡处死。无菌条件下取心室肌组织，剪成1m澎大小，置于培养瓶中，用DMEM清洗2次。加人0.1%的胰酶置于37℃水浴中消化8min，吸取上清，加人血清终止消化、用200目不锈钢网过滤收集上清，离心收集细胞，加人含10%血清的DMEM培养液，用吸管吹打均匀后放置于5%COZ,370C培养箱中，培养1h，以去除成纤维细胞。收集未贴壁细胞，其中主要为心肌细胞。③组织工程化心肌条带的制备:液态I型胶原(1.9mg/ml)与2xDMEM等比例混合，用0.1mol/LNaOH调为中性，再加人10%的Ma-trinel将分离的新生大鼠心肌细胞与上述混合物混合，使其终浓度为2x10'/ml;加人环形槽中，置5%C02,37℃培养箱中，60min后加人培养液。心肌细胞/胶原混合液即可在槽中凝固成带状的心肌细胞/胶原复合物。共制备巧条心肌条带心肌条带在槽中培养7d后，移出复合物条带，条带套在静态拉伸装置的两平行金属圆杆上，调整两金属杆间距离，使条带受到幅度为10%静态拉伸，并继续体外培养7d6④组织工程化心肌片层移植心便大鼠模型:制作心梗大鼠模型成功之后，置笼中饲养，I周后取移植组大鼠再次开胸，暴露心脏左室前壁，分离心包与心梗区粘连，肉眼可见梗死区形状不规则，便死灶呈苍白色。将心肌片层用1号丝线将其四角缝合至心梗区，使之与梗死区紧密相贴。移植心肌片层给予常规饲料饲养4周后行相关实验检测。本次实验中，心脏冠状动脉左前降支毗邻的左室前壁部位为梗死区，特征为此梗死区外膜变为白色斑片状。左室侧壁为非梗死区。假手术组与心梗组均不行心肌片层移植。
　　1.5有效不应期(ERP)测量心梗造模后5周，各组腹腔静脉注射10%水合氯醛溶液(0.3m1/100mg)，仰卧位固定于工作台_L，用针刺电极刺人大鼠四肢皮下与体表心电图机(ECG9801)相连，纸速25一50mm/s，行气管插管，暴露大鼠心脏。将双极电极接触导管缝合固定于左室心外膜表面，双极刺激电极则置于心室游离壁外膜上，电极间距1mm。由心脏电生理刺激仪发出刺激信号，波宽2ms，电压为2Vo由LEAD2000心内电生理仪器记录。先记录大鼠安静麻醉状态下的心电图，计算出基础心率。由心脏电生理刺激仪发出刺激信号，基础刺激以高出基础心率10%的频率起搏心室，脉宽2ms。首先测定心室起搏闽值，以起搏闽值的2倍作为输出电压。期前刺激Sz脉宽和电压与S相同，确定起搏刺激可以夺获心室后，在连续发放4个起搏刺激S，后发放早搏刺激S}，然后以10ms的步长进行负扫描，直到不能引起心肌产生可传播的动作电位，此时的S,SZ间期定义为ERP.
　　1.6生长相关蛋白(GAP43)和自主神经〔酪氨酸经化酶(TH)和乙酸胆碱转移酶(ChAT)〕的免疫组化检测ERP测量后经心脏灌注生理盐水250ml，随后在体灌注4%多聚甲醛固定后取梗死周边区和非梗死区(假手术组于相应位置)组织继续在4%福尔马林中固定48h，脱水、浸蜡、包埋及切片。切片60℃预热30min，脱蜡、构椽酸纳微波炉解冻温度抗原修复15min。冷却1ho3%H20:反应10min以阻断内源性过氧化物酶。滴加一抗4℃过夜，然后滴加辣根过氧化物酶标记的二抗(北京中山金桥公司提供)，每一操作步骤间均用PBS冲洗，最后用DAB试剂盒显色。阴性对照以PBS代替一抗，应用计算机辅助图像分析系统(MoticImages3000)计算神经密度。神经密度以神经纤维面积与总检测面积比值表示(N,m2/mm2，切片全部面积被分割成连续的1024N,mZx768m耐大小的独立视野，所有视野神经密度的平均值为该切片平均神经密度，每个切片中选择5个神经密度最大和5个神经密度最小的视野，神经密度均值之差为局部神经分布的不均一性。
　　1.7统计学处理用SPSS13.0统计软件进行统计分析。计量资料用x1、表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD法检验，以P<0.O5为差异有显著性。
　　2结果
　　2.1模型制作情况在造模成功后的4周后，心梗组及移植组制作稳定。心梗组模型成功率达到d5%，但死亡率达到25%，另有10%的心梗模型不成功。手术后大鼠死亡原因:呼吸衰竭，心力衰竭。
　　动物死亡后根据数量择日手术补齐。假手术组11导联ST段位于基线水平，左室前壁呈红色。心梗组且导联ST段抬高或QRS波增宽畸形。梗死区形状不规则，梗死灶呈苍白色。移植组fl导联ST段位于基线水平。组织工程化心肌条覆盖梗死区，部分心肌条与心梗区融合成一体。见图1.
　　2.2各组梗死周边区和非梗死区ERP变化与假手术组比较，心梗组梗死周边区ERP显著缩短(P<0.0l)，非梗死区未见明显改变(P>0.05);与心梗组比较，移植组梗死周边区ERP延长(P<0.O1)，非梗死区未见明显改变(P>0.O5)。见表1.
　　2.3各组梗死周边区HE染色假手术组心肌细胞结构完整，排列整齐，细胞核清晰。心梗组心肌细胞排列紊乱，坏死。心肌细胞之间的间隔增宽。移植组心肌细胞排列较心梗组整齐，心肌细胞之间间隔较假手术组宽，少数心肌细胞挤压一团，大小不一。如图202.4各组大鼠神经再生和神经分布不均一性比较与假手术组比较，心梗组和移植组GAP43阳性神经密度明显增加(均P<0.O1)，见图3。与假手术组比较，心梗组TH和ChAT阳性神经密度不均一明显增加(均P<0.01)，移植组TH和ChAT阳性神经密度不均一未见明显改变(均P>0.O1)。见图495，表2。
　　3讨论
　　Zhou等研究结果显示，心梗不仅造成梗死区域心肌去神经支配，并且通过损伤经过梗死区域心外膜的交感神经轴突，在心梗后5一10min起始造成梗死区域远端非梗死区域心肌不均一去神经支配，其去神经化呈进行性加重。随后在梗死区域及非梗死区域心肌均出现神经再生，且部分区域心肌出现交感神经过度再生。反映神经轴突发生的GAP43阳性神经细胞密度在心梗后3h即增加，在心梗后1周达峰并亦可持续2个月。GAP43阳性细胞在心肌呈散在分布，其密度在梗死周边区域大于非梗死区域。交感神经标志物TH阳性神经细胞分布亦呈现上述特征。这种生长因子和神经再生的时空一致性提示了生长因子对心梗后神经重构具有重要作用。心梗后心肌组织中交感神经密度增加，交感神经兴奋时释放人心肌组织的交感神经递质也相应增加。这些神经递质通过其对CaZ十、K},Cl一离子通道及Ca2+转运体的作用，加重升高心室复极离散度，易化室性心律失常。笔者的研究显示，与假手术组比较，心梗组GAP43阳性神经密度明显增加，TH和ChAT阳性神经密度不均一明显增加。移植组GAP43,TH和ChAT未见明显改变。国内有实验证实，左室心梗发生后，其梗死区周围出现神经重构现象，表现为自主神经过度支配，并受心肌中神经生长因子蛋白表达的调节。笔者的结果提示，心梗后心脏神经纤维存在形态、分布及密度的改变，即神经重构，其可促进心梗后心律失常的维持，对心梗区移植补片后，可逆转神经纤维重构，从而减少心梗后心律失常的发生。
　　Zimmerman。等[7〕构建高度分化的心肌组织，移植到免疫抑制的大鼠心梗部位28d后，工程化心肌组织形成了较厚的心肌层，与天然心肌的电偶联未发生延迟，没有出现心律不齐。Leor等将小块大鼠和人的胎儿心肌组织移植到梗死的大鼠心脏上，移植物在梗死心肌中至少存活了2个月。Kofidis等将新生鼠心肌细胞种植在胶原支架上，在MEM培养液中培养，经组织学，电生理和力度测定表明形成自发跳动的心肌组织，并具有自体心肌电机械学特性。Bursac等用三维支架材料替代损伤的细胞外基质，并进行了电生理的研究。在后期的工作中，他们通过改变支架和生物反应器的参数成功地改变工程化心肌组织的结构和电生理特性。笔者的研究显示，与假手术组比较，心梗组大鼠的ERP缩短，移植组ERP无缩短。结果证实，工程化心肌补片电生理特性稳定，与宿主心脏在电功能卜的整合促进受损心肌功能的部分恢复。这些实验的结果为我们提供了在体外研究心肌发生和心肌生理学、生物学和药理学的基础。除此之外，也给工程化心肌修复或替换梗死组织带来了希望。
　　参考文献
　　[1] Theo Kofidis,Darren R. Lebl,Eliana C. Martinez,Grant Hoyt,Masashi Tanaka,Robert C. Robbins.  Novel Injectable Bioartificial Tissue Facilitates Targeted, Less Invasive, Large-Scale Tissue Restoration on the Beating Heart After Myocardial Injury[J]. Circulation . 2005 (9 Suppl)[2] Shengmei Zhou,Lan S. Chen,Yasushi Miyauchi,Mizuho Miyauchi,Saibal Kar,Simon Kangavari,Michael C. Fishbein,Behrooz Sharifi,Peng-Sheng Chen.  Mechanisms of Cardiac Nerve Sprouting After Myocardial Infarction in Dogs[J]. Circulation Research: Journal of the American Heart Association . 2004 (1)