RHD711delC等位基因检测和频率计算

RHD711delC等位基因早期被称为RHD710de1C等位基因，最早报道于2001年的GenBankAF390112，该RHD等位基因由于在RHD基因第710-711位(为CC)缺失1个碱基C，导致D抗原编码阅读框架错位，提前形成终止密码，或编码截断蛋白，个体红细胞膜不能表达正常可检测的D抗原。现证实该等位基因是中国人群中常见的无效RHD等位基因，其在Rh阴性个体中的检出率仅次于RHD-RHCE(2-9)-RHD融合等位基因。目前国际输血协会(ISBT)正式命名该等位基因为RHD＊01N.16。
　　Rh血型D抗原经间接抗人球蛋白试验(IAT)检测，分为Rh(D)阳性和Rh(D)阴性表型,Rh(D)阴性表型包括D放散型(DEL)和真实Rh(D)阴性表型。欧洲白人真实Rh阴性表型个体，大多是因RHD基因完全缺失致D抗原无法表达而形成;而非洲黑人则大多是因个体携带无效RHD等位基因而形成Rh阴性表型;我国汉族个体中约9000的真实Rh阴性表型，是因RHD基因完全缺失形成，另有约10%则是因携带无效RHD等位基因形成的。在无效RHD等位基因中，主要为RHD-RHCE(2-9)-RHD和RHD711deIC等位基因。以往文献多报道RHD711delC等位基因在我国汉族Rh(D)阴性人群的检出率但少有报道该等位基因在Rh(I))阳性人群中的检出率。本文采用序列特异性引物-PCR技术(PCR-SSP)检测汉族Rh(D)阴性、D抗原弱阳性表型.以及Rh(D)阳性个体的RHD711delC等位基因，进而计算其在一般人群中的基因频率，现报道如下。
　　材料与方法
　　1 研究对象和样本2008年1月一2012年6月间陕西省血液中心首次无偿献血者共890408人.其中3名回族、1名满族和1名土家族捐血者.其余均为汉族，年龄18-55岁，约55%献血者出生在陕西省当地，其余来自全国各地。采集全血样本分离红细胞，及时检测D抗原，采用常规方法提取需要做进一步检测的样本DNA,-40℃保存备用。
　　2 血清学试验RI:血型n抗原鉴定.执行中国输血技术操作规程(血站部分)的实验室操作规范。所有样本均先以盐水法.使用单克隆IgM抗-D抗体(Caone:175-2)和单克隆IgG抗-D抗体(Clone:4151E4)混合试剂(DominionBiologicalsLimited.NovaScotia,Canada)检测红细胞膜D抗原.然后采用IAT法确认。盐水法检测为阳性的样本.直接判断为Rh(D)阳性表型;盐水法检测阴性而IAT检测结果阳性时‘判读为D抗原弱阳性表型(其中包括弱D型和部分D型.本文不户鉴别):IAT法检测结果为阴性时.判读为Rh(D)阴性表型。
　　3 RHD711delC等位基因测定参考文献报道的PCR-SSP法测定RHD711delC等位基因.但本文仅使用上述检测体系的"RHD711de1C等位基因特异性检测管”的引物和反应认条件、实验阴性对照.同时使用一般Rh(D)阳性DNA携带正常RHD基因)和一般Rh(D)阴性DNA(RHD基因完全缺失型)样本。
　　4 RHD杂合型测定采用以往报道的双管PCR技术。两管nc尺反应分另}l检测被检样品的RHD基因第一外显子区域的特定序列.以及融合Rh盒子(CybridRhesusbox)的特异性序列.根据结果判断被检样本是否存在融合Rh盒子。即是否存在RHI)基因完全缺失，以及是否存在RHD基因第一外显子.即是否存在RHD基因。依据两管PCR反应结果，综合判断个体的RHD基因数目，鉴定RHD+/RHI)一、RHI)十/RHD十、RHD一/RHD一合子型。
　　结果
　　1 D抗原表型分类890403名无偿献血者经过IgM抗一D盐水法和IAT确认，2385人鉴定为Rh(D)阴性，108人为D抗原弱阳性表型(包括弱D型和部分D型)，其余887910人为Rh(D)阳性。
　　2 RHD711de1C等位基因检测和基因型2385名Rh(D)阴性个体中19人检出携带RHD711delC等位基因(0.80%)，合子型检测显示均为RHD711delC/d基因型;108名D抗原弱阳性个体中，未发现携带RHD711de1C等位基因的个体;随机抽检的960名Rh(D)阳性个体中，1人检测RHD711de1C等位基因阳性，为RHD711de1C/RHD斗基因型。
　　3 RHD711de1C基因频率计算2385名Rh(D)阴性个体中RHD711de1C等位基因检出19人;108名D抗原弱阳性表个体中检出等位基因数为0;960名Rh(D)阳性个体中检出1人携带RHD711de1C等位基因，检出率0.001042，推算887910名Rh(D)阳性个体(890403--1082385),该等位基因携带者约925人，由于这些个体的表型为I)阳性，因此均为RHD711de1C/RHD+杂合型。由此计算RHD711de1C等位基因在被检人群中的基因频率为(19+925)/890403X2=0.000530。
　　由于RHD711de1C等位基因主要存在于Rh阴性人群.根据2385名Rh阴性个体中检出19人为RHD711de1C%d基因型.计算其频率为19/2385X2=0.003983，按文献报道的d基因(不表达血清学IAT可检测的n抗原的等位基因)频率0.05641算RH1}711de1C等位基因在一般人群中的频率为0.003983X0.05641=0.000225。因此，RHD711dc1(}等位基因在中国汉族一般人群中的等位基因频率为0.000225-0.000530。
　　讨论
　　采用经典间接抗人球蛋白试验确认的Rh(D)阴性个体，再采用吸收放散方法检测红细胞膜D抗原，结果阳性者称为D放散型，或DEL型，其余即为真实Rh(D)阴性表型。我国汉族Rh阴性率约0.3%，本文调查结果为0.27%(2385/890403),按照国内报道的DEI一占Rh阴性人群的26%，则真实Rh阴性表型在我国汉族人群中的检出率约0.199%一0.222%，即0.2%。这些个体中90%的人2条染色体均完整缺失RHD基因，约10%携带1-2条RHD基因，其中大部分为RHD-RHCE(2-9)-RHD融合等位基因及RHD711delC等位基因。一般认为RHD711delC等位基因在Rh阴性个体中的检出率约1%-2%，本文对2385名IAT确认的Rh阴性样本检测，发现19名携带RHD711delC等位基因，检出率0.80%，略低于以往的文献报道。
　　本文采用2种方法分析RHD711delC等位基因在我国汉族人群中的基因频率，其一由于样本量非常大，所以采用了直接计算调查人群的RHD711delC等位基因频率，但该方法明显受RHD711delC等位基因在Rh(D)阳性个体中检出率的影响，特别是本文随机测定的960份样本中，仅检测到1例个体携带该等位基因。为减少其对基因频率计算的影响，我们采用了第二种方法，以本文对Rh阴性个体RHD711delC等位基因的检出率为基础，避开960份Rh阳性检出1例携带等位基因可能形成的偏差，然后结合以往文献报道的d基因的频率，再计算RHD711delC等位基因的人群频率，可能较前一种方法准确。但不论采用何方式计算等位基因频率，不同的影响因素不可避免，因此.相比单独通过某种方法计算，通过综合计算其频率范围可能具有更好的参考价值。