幽门螺杆菌对两种抗生素的耐药性及相关基因突变分析

全球半数以上人口感染幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,H.pylori)，我国人群H.pylori感染率为56.22%。H.pylori感染不仅与胃炎、消化性溃疡、胃癌等疾病密切相关，而且与多种胃肠道外疾病相关，1994年已被WHO列为一级致癌原。三联疗法为国内外推荐的一线治疗方案，其根除率正逐年下降，在某些地区已低于70%，远低于感染性疾病80%的起始治愈率。日益严重的细菌耐药是根除率下降的最主要原因。本文采用药敏实验法和PCR产物测序法对26株H.pylori临床分离株进行了克拉霉素和左氧氟沙星的耐药检测，以探讨H.pylori耐药和基因突变的关系。
　　材料与方法
　　1 样本杭州致远医学检验所提供的26株幽门螺杆菌临床分离株。
　　2 药敏实验分离培养H.pylor;菌株，采用E-test法测定H.pylori对克拉霉素和左氧氟沙星的最低抑菌浓度(Minimalinhibitoryconcentration,MIC)。耐药判定标准:克拉霉素MIL>1ug/ml，左氧氟沙星MIL>1ug/m1。
　　3 PCR测序法
　　3.1 用深圳市普瑞康生物技术有限公司DNA提取液与菌液11等体积混合，100空气浴10min;4、冷却30min,13000r/min离心5min，取上清转移至新离心管，-20℃冻存。3.223SrRNA和gyrA基因片段扩增及测序:参照文献设计上下游引物。PCR反应体系50ul:DNA模板5ul,500nmol/L上下游引物，1UrTaq酶，200umol/LdNTP，1XPCRbuffer，ddH2O29ul。反应条件:94℃预变性5min,94℃变性30s,52C、退火30s,72℃、延伸30s循环35次，72℃延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，使用TIANGEN普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，按说明书对PCR产物进行切胶回收纯化后，送北京博迈德科技发展有限公司测序。测序结果用Vec-forNTIsuite7.1软件与H.pylori标准菌株26695序列进行比对。
　　结果
　　1 H.pylori药敏实验检测26例H.pylori临床分离株中，6例对克拉霉素耐药，6例对左氧氟沙星耐药，8例对克拉霉素和左氧氟沙星双重耐药，剩余6例为敏感菌株。
　　2 克拉霉素耐药株在23SrRNA基因的突变和左氧氟沙星耐药株在gyrA基因的突变26例H.py-lori临床分离株经PCR均扩增出23SrRNA基因中含克拉霉素耐药决定区的目的片段。测序结果显示14例克拉霉素耐药菌株的23SrRNA基因发生点突变，突变位点为2143(A2143U)(表2)026例H.pylori临床分离株经PLR均扩增出gyrA基因中含哇诺酮类耐药决定区(quinolone-resistance-deter-miningregion,QRDR)的目的片段。测序结果显示14例左氧氟沙星耐药菌株的gyrA基因发生突变，突变位置是第87和91位氨基酸。
　　讨论
　　1982年澳大利亚学者Warren和Marshall首次从人体胃组织中分离出一种弯曲螺旋状革兰阴性杆菌，称为幽门螺杆菌。目前公认H.pylori感染与多种胃部疾病相关。由于治疗的不规范和抗生素耐药，尤其是对甲硝哇、克拉霉素等的耐药，三联疗法对H.pylori的根除率正逐年下降。MaastrichtN指出克拉霉素耐药为标准三联根除率下降的最主要因素。左氧氟沙星常作为克拉霉素高耐药的替代药物。研究发现在中国H.pylori对克拉霉素的原始耐药率已达37.200，继发耐药率更高，喹诺酮类药物的耐药率为25%。
　　此前研究表明，23SrRNA基因发生突变是导致H.pylori对克拉霉素耐药的主要原因，23crRNA基因突变位点有A21420,A2112G,A2143U,A2146C,A2147G，A2223G等;gyrA基因突变是导致H.pylori对喳诺酮类耐药的主要原因，突变主要发生在第87和91位氨基酸。本研究26例H.pylori临床分离株中，14例克拉毒素耐药菌株均为A2143(i突变，未发现其他基因位点突变;14例左氧氟沙星耐药菌株中，9例菌株是第87位氨基酸突变，5例是第91位氨基酸突变。表明浙江地区H.pylori对克拉霉素耐药菌株基因突变主要为A2143G，对左氧氟沙星耐药菌株基因突变主要发生在gyrA基因的第87和91位氨基酸。
　　根据H.pylori耐药情况来指导临床用药，对患者进行个体化治疗，能有效提高根除率。细菌培养是H.pylori感染诊断的金标准，可进行药敏实验指导临床用药，但该方法复杂、耗时，培养条件苛刻，敏感度低。近些年来用于检测耐药基因突变的分子生物学检测方法快速发展，具有快速、敏感等优点，是根除H.pylori个体化治疗的发展方向，个体化治疗是应对日益严重的耐药情况并根除H.pylori感染的发展方向，而基因型耐药检测方法的准确性有赖于更广泛的临床验证。