Apogossypolone联合神经酰胺诱导鼻咽癌CNE-2细胞凋亡与自噬

鼻咽癌在我国两广地区高发,初诊时晚期患者约占70%以上。早期采用单纯放疗,晚期采用放化联合治疗。放射治疗失败的原因主要是远处转移和局部复发。Apogossypolone(ApoG2)是棉酚的一种新型衍生物,作为一种Bcl-2小分子抑制剂,毒副作用小,患者耐受性好,对胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌等多种肿瘤有抑制作用。神经酰胺是细胞膜神经鞘磷脂水解产生的一种脂质分子,在促进细胞死亡中有重要的生物学活性。ApoG2和神经酰胺毒副作用均较小,两者联合应用在国内外鲜见报道。本研究主要探讨两种靶向药物ApoG2联合神经酰胺体外作用对人鼻咽癌CNE-2细胞生长抑制,并初步探讨其可能机制。
　　1材料与方法
　　1.1材料与主要试剂
　　鼻咽癌CNE-2细胞株由南方医科大学肿瘤研究所冻存。ApoG2由美国密歇根大学医学院肿瘤中心徐梁教授惠赠。神经酰胺购于Sigma公司。
　　1.2CCK-8检测药物对细胞的生长抑制作用
　　按每孔5×10的3次方个细胞接种于96孔培养板,培养箱中培养胚h,弃废液,设ApoG2、神经酰胺药物浓度均为5、10、20、40、60、80umol/L,两药联合作用时保持两药终浓度不变;对照组为0.1%DMSO培养液,空白对照组不加细胞悬液只加培养液,每组4个平行孔,加培养液100uL。继续培养48h,弃废液,每孔加100uL新培养液及CCK-8液10uL,继续孵育1h。酶标仪检测450nm波长下各孔OD值,实验重复3次,分别计算各组的增殖抑制率,抑制率(%)=1-(OD实验组-OD空白组)/(OD实验组-OD空白组)×100%。CDI=AB/(A×B)。AB为联合作用组吸光度值与对照组吸光度的比值;A、B是单药作用组的吸光度值与对照组吸光度的比值。当CDI<1时,两药有协同作用;CDI=1时两药作用相加;CDI>1时,两药拮抗。
　　1.3Hoechst33258染色观察细胞凋亡及吖啶橙(AO)染色、透射电镜观察细胞自噬形态学变化
　　消化传代细胞,待细胞生长至50%-70%时,分为对照组(0.1%DMSO),ApoG2药物组(20umol/L)神经酰胺药物组(20umoVL),联合用药组(ApoG2、神经酰胺均为20umol/L)。培养48h后弃废液,加Hoechst33258染色液,避光染色5min,荧光显微镜下观察细胞凋亡形态。
　　按上述分组处理细胞，加终浓度为1mg/L的AO避光作用15min,PBS洗涤3遍，荧光显微镜下观察细胞自噬形态。收集按上述分组处理的细胞1x10的6次方个，离心，去上清，固定，送电镜室进行常规切片，透射电镜下观察细胞超微结构。
　　1.4FCM检测细胞凋亡率及自噬荧光强度按上述分组处理细胞，各收集5x10的5次方个细胞，加人400ul的BindingBuffer及5uLAnnexinV-FITC混匀后，再加人5uL碘化丙啶(propidiumiodide,PI)混匀;避光反应10min，上机检测细胞凋亡率。细胞分组处理后，各收集5x10的5次方个细胞，加1mg/L的叮陡橙避光作用15min,PBS洗涤3次，上机检测自噬荧光强度，用FL1-Height和FL3-Height荧光通道分别代表绿色荧光和红色荧光，实验重复3次。
　　1.5WesternBlot检测bcl-2、Beclinl蛋臼表达按上述分组处理细胞。收集总蛋白，BCA法测蛋白浓度，12%SDS-PAGE胶上电泳，15V,60min半干转膜仪转至PVDF,S%脱脂牛奶封闭1h。洗膜后，加人Bcl-2多克隆抗体(1:500稀释)、Beclinl多克隆抗体(1:500稀释)4℃过夜。洗膜后，二抗(1:2000稀释)孵育1h。加化学发光剂ECL，暗室曝光，显影、定影后扫描，用ImageJ图像分析系统分析结果。蛋白的相对表达量为目的蛋白与内参p-actin的灰度值之比:实验重复3次。
　　1.6统计学方法采用SPSS13.0统计学软件进行数据处理，计量数据采用x1、表示，组间差异采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1CCK-8检测药物对细胞的生长抑制作用ApoG2与神经酚胺单独作用CNE-2细胞48h，计算各浓度抑制率及CDI，差异具有统计学意义(F=611.533，P<0.001;F=495.730,P<0.001)，联合用药组抑制率随着两者药物浓度的增加逐渐增加，两者之间存在交互效应(F=13.290,P<0.001)。当药物浓度低于40umol/L时，CDI<1，两者发挥协同效应;当药物浓度为60,80umol/L时，CDI>1，两药作用相加甚至拮抗。作用48h后ApoG2与神经酞胺IC。值分别为49.20umol/L和62.04umol/L。
　　2.2CNE-2细胞凋亡及自噬形态学变化
　　Hoechst33258染色:对照组、神经酞胺组细胞染色质均匀，核形态规则，ApoG2组及联合用药组可见染色质凝集和碎裂等凋亡特征，且联合用药组明显较ApoG2组多。
　　AO荧光染色:对照组胞核与胞浆呈亮绿色荧光，ApoG2组、神经酞胺组及联合用药组胞浆或胞核染成亮红色荧光，为酸性自噬泡，且联合用药组较ApoG2组及神经酸胺组增多。透射电镜观察:与对照组相比，联合用药组细胞体内大空泡增多，有膜性双层结构的自噬小体形成。
　　2.3FCM检测凋亡率及自噬荧光强度
　　本实验凋亡率用右上象限与右下象限之和表示。叮陡橙能使酸性滤泡染成亮红色荧光，细胞质及核仁染成亮绿色和暗红色荧光亮红色荧光强度与酸性滤泡的酸度及容积成正比自噬荧光强度采用左上象限与右上象限之和表示FCM检测凋亡率、自噬荧光强度结果，凋亡率组间差异具有统计学意义(F=106.72,P<0.001)，联合用药组与其他三组比较差异均具有统计学意义(P<0.05)，两药联合凋亡率更高自噬荧光强度组间均数差异具有统计学意义(F=140.77,P<0.001)，联合用药组与其他三组比较差异均具有统计学意义(P<0.05)，两药联合自噬荧光强度更高。
　　2.4Westernblot检测Bcl-2,Beclinl蛋自表达情况
　　Westernblot检测显示，Bcl-2蛋自相对表达量，组间均数差异具有统计学意义(F=111.071,P<0.001)，联合用药组与其他里巨比较差异具有绷卜学意义(P<0.05).联合用药组Bcl-2蛋白的表达量更低二Beclinl蛋自相对表达量，组间均数差异具有统计学意义(F=62.271.P<0.001)，联合用药组与其他三组比较差异均具有统汁学意义(P<0.05)，联合用药组Beclinl蛋白的表达母更高
　　3讨论
　　ApoG2是去除两个醛基后合成的新型棉补酚衍生物，是一种更新、更有效、毒副作用小的Bcl-2小分子抑制剂，能够诱导多种细胞凋亡‘、近来研究表花能诱导肿瘤细胞发生自噬，本组前期的研究也证月棉酚能诱导乳腺癌细胞发生凋亡与自噬卜近来研完表明神经酞胺(ceramide)能通过上调Beclin-1诱导乳腺癌细胞发生自噬。在恶性胶质瘤细胞U373-MG和T98G细胞中，神经酞胺能诱导其发生自噬性细胞死亡。本研究CCK-8检测结果表明ApoG2和神经酞胺均对鼻咽癌CNE-2细胞具有明显的生长抑制作用，联合应用能增强抑制效果。根据CDI，在低剂量联合时表现为协同效应，在高剂量时表现为相加甚至拮抗。本研究发现，联合作用凋亡率并不高，说明对细胞生长的抑制除了凋亡还有其他途径。透射电镜和AO染色表明自噬性细胞死亡的存在，FCM检测也发现联合作用自噬荧光强度增加。说明自噬在联合作用抑制细胞增殖中发挥着重要作用。有研究发现Bcl-2既能诱导凋亡，又能影响自噬的发生〔9}}Beclinl蛋白在自噬与凋亡中起重要作用。Beclinl蛋白具有BH3结构域，BH3的类似物能竞争性对抗Beclin1与Bcl-2之间的结合，能够使Beclin1释放出来促进自噬。本研究WesternBlot检测联合应用能使Bcl-2表达下调，诱导CNE-2细胞凋亡;Beclinl表达上调，诱导自噬，与上述研究结论一致。
　　综上所述，ApoG2与神经酞胺联合作用CNE-2细胞，能增强单药抑制效果，低浓度联合时协同抑制肿瘤生长。同时自噬在抑制肿瘤增殖中也发挥了作用。
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