SFRP5逆转白血病多药耐药性的研究

白血病多药耐药(multidrugresistance,MDR)是化疗失败,造成白血病复发和难治的主要原因。由多药耐药基因(multidrugresistancegene,MDR1)编码的P-gp过表达造成抗癌药物外排增加、药效降低,是MDR形成的重要原因之一。通过调节P-gp逆转MDR是临床治疗的难点及科学研究的重点。SFRP5是分泌型糖蛋白家族成员之一,通过竞争性抑制Wnt信号通路特异性受体卷曲蛋白(Fz)受体从而抑制Wnt的活化。有研究显示在白血病细胞中存在SFRP5基因启动子区域甲基化,导致SFRP5蛋白表达缺失或下调,但这种SFRP5蛋白表达下调在肿瘤发生发展中的作用,特别是对于P-gp介导的多药耐药的作用尚不明确。在本研究中,选择SFRP5高度甲基化的多药耐药白血病细胞系KG1a作为研究对象,验证SFRP5对白血病多药耐药的作用。
　　1材料与方法
　　1.1实验材料人白血病KG1a细胞株来自中国医学科学院血液病研究所。表达SFRP5的质粒EⅩ-00006-M02、表达绿色荧光蛋白的EX-EGFP-M02质粒购自美国GeneCopoeia公司。Plasmidminipurificationkit试剂盒购自德国QIAGEN公司。Lipofectamine2000TransfectionReagent购自美国Invitrogen公司。PE标记的P-gp抗体购自美国BD公司。SYBRPremixTaqTM试剂盒购自日本TaKaRa公司。
　　1.2方法
　　1.2.1细胞培养和转染KG1a细胞用含10%胎牛血清1640培养基37℃,5%二氧化碳细胞培养箱中培养。适量细胞接种在6孔板中,过夜后用脂质Lipofectamine2000TransfectionReagent分别将表达SFRP5的质粒EⅩ-00006-M02,表达绿色荧光蛋白的EⅩ-EGFP-M02质粒进行细胞转染。6h后换液,更换20%血清1640培养液继续培养72h进行后续实验。
　　1.2.2Westernblot检测SFRP5及P-gp蛋白表达情况收集细胞,PBS洗2次,每10的7次方个细胞加1mL预冷的RIPA裂解液,混匀,冰上震30min,4℃,12000rpm离心30min,收上清,BCA方法测蛋白浓度。取50ug蛋白样品加入上样缓冲液,100℃煮沸5min,用SDS-PAGE分离,将蛋白转移到硝酸纤维素滤膜上。将硝酸纤维素滤膜加人含有5%脱脂奶粉的封闭液中,4℃摇床孵育过夜,加入兔抗人SFRP5及兔抗人P-gp一抗,4℃摇床孵育过夜。除去一抗,加入鼠抗兔二抗,室温下摇床孵育2h,除去二抗。加显色剂,在X射线胶片曝光成像并分析。
　　1.2.3real-timePCR检测MDR1表达应用red-timePCR检测KG1a,KG1yeGFP及KG1a/SFRP5细胞内MDR1mRNA水平。引物序列:MDR1:上游5'-ATAATGCGACAGGAGATACG-3',下游5'-TTGCCATTGACAGGATAGG-3';GAPDH:上游5'-AGTCAACGGATTTGGTCGTA-3',下游5'-GGAACATGTAAACCATGTAG-3';PCR扩土曾程序:95℃30s,95℃5s,60℃35s,共40个循环。
　　1.2.4荧光显微镜观察细胞膜表面P-gp水平收集KG1a,KG1a/eGFP及KG1a/SFRP53组细胞,调整细胞数为5×10的5次方。加人4uL鼠抗人PE-P-gp直标抗体,4℃孵育30min。PBS洗涤细胞2次,将细胞滴于载玻片上,用盖玻片盖上细胞,荧光显微镜下观察呈现红色荧光的细胞情况。
　　1.2.5流式细胞仪检测细胞内药物浓度收集KG1a,KG1a/eGFP及KG1a/SFRP53组细胞,调整细胞数1×10的6次方。将罗丹明(终浓度0.3uM)溶于无血清1640培养液中，将细胞沉淀重悬于2mL所配置的培养液中。应用维拉帕米(10uM)作为阳性对照。,37℃水浴震荡培养2h。PBS洗1次,流式细胞仪检测细胞内荧光强度。
　　1.2.6MTT方法检测细胞耐药性收集KG1a,KG1a/eGFP及KG1a/SFRP5细胞,接种于96孔板,实验设3个复孔,并设空白对照。接种8h后,加入ADR,使终浓度依次为(0、0.1、0.25、0.5、1、5、10、20、50uM)MTT方法测各孔OD值,计算IC实验重复3次。
　　1.3统计学分析
　　实验数据结果以表示,使用SPSS13.0统计软件进行统计学处理,组间比较用单因素方差分析(ANOⅤA)或两组之间比较采用t检验,P<0.05为差异具有显著性。
　　2结果
　　2.1KG1a细胞转染SFRP5后表达鉴定
　　荧光显微镜下观察转染效率可达到90%。应用流式细胞仪检测eGFP阳性细胞为92.1。应用Westernblot检测SFRP5表达情况。结果显示,转染后KG1a/SFRP5细胞恢复SFRP5表达,而KG1a/SFRP5细胞内SFRP5表达仍缺失。
　　2.2Red-timePCR检测MDR1表达
　　应用Red-timePCR检测KG1a,KG1yeGFP及KG1a/SFRP5细胞内MDR1mRNA水平。结果显示KG1a/SFRP5细胞中MDR1mRNA水平显著下降(P<0.01)。
　　2.3Westernblot检测P-gp蛋白表达采用Westernblot检测KG1a,KG1a/eGFP及KG1a/SFRP5细胞中总体P-bop表达水平,结舫KG1a/eGFP细胞中P-gp表达被下调。
　　2.4荧光显微镜观察细胞膜表面P-gp表达
　　应用PE标记的P-gp直标抗体检测KG1a,KG1a/eGFP及KG1a/SFRP5细胞膜表面P-gp的表达,在荧光显微镜下观察红色荧光强度。结果显示,KG1a/SFRP5细胞红色荧光强度明显弱于KG1a及KG1a/eGFP细胞。
　　2.5流式细胞仪检测细胞内药物浓度
　　应用流式细胞仪检测细胞内罗丹明的荧光强度,代表细胞内药物浓度变化。应用维拉帕米(Verapamil)作为阳性对照,实验重复3次。结果显示KG1a/SFRP5细胞内罗丹明荧光强度较KG1a及KG1a/eGFP细胞明显增多(P<0.01)。
　　2.6MTT方法检测细胞耐药性变化KG1a中ADR的IC为(0.963±0.115)uM;KG1a/eGFP中ADR的IC为(0.917±0.138)uM;KG1a/SFRP5中ADR的IC为(0.573±0.131)uM。KG1a/SFRP5对ADR的IC较KG1a及KG1a/eGFP相比明显下降(P<0.01)。
　　3讨论
　　SFRP5是SFRPs家族的一个分泌型蛋白,大量的研究显示在多种肿瘤细胞中存在SFRP5基因启动子区甲基化,并导致蛋白表达的下降。Griffiths等的研究提示SFRPs甲基化导致的SFRP5蛋白表达下降可能增加AML复发的风险。Su等研究卵巢癌发现叩RP5甲基化状态与卵巢癌对顺铂的耐药性有关,通过基因转染恢复SFRP5表达后减弱Wnt信号活性,能够抑制小鼠卵巢癌细胞生长、浸润及肿瘤形成。同时SFRP5恢复表达还能够抑制上皮-间质转化,下调AKT2,增加卵巢癌细胞对化疗的敏感性。
　　由MDR1编码的P-gp过表达造成抗癌药物外排增加、药效降低,是多药耐药形成的主要原因。Lim等以大鼠脑内皮细胞及人大脑内皮细胞系hCMEC/D3作为研究对象,发现应用GSΚ-3抑制剂激活β-catenin通路能够促进MDR1基因转录及P-gp蛋白表达,并伴随药物外排的增加。Flahaut等报道了21例神经母细胞瘤的患者化疗后存在FZD1及MDR1的过表达。应用specificmicro-adaptedshorthairpinRNA(shRNAmir)介导FZD1基因沉默后,MDR1表达明显减少。
　　为了验证SFRP5在P-gp介导的白血病多药耐药中的作用,本研究选择了SFRP5高度甲基化的多药耐药白血病细胞系KG1a,应用转基因的方法恢复其SFRP5的表达,发现KG1a/SFRP5中MDR1mRNA水平显著下降,P-bop表达水平在SFRP5表达恢复后亦被下调。P-gp是膜蛋白,其表达的多少直接影响药物外排。本研究应用荧光显微镜观察细胞膜表面的P-gp,发现其表达明显减少。进一步应用流式细胞仪检测细胞内药物浓度来评价P-gp的功能,发现KG1a/SFRP5细胞中药物浓度增加。应用MTT方法计算细胞耐药性的变化,发现SFRP5表达恢复的KG1a细胞耐药性下降。这些结果证明了SFRP5能够逆转P-gp介导的白血病多药耐药。
　　本研究证实SFRP5蛋白表达缺失参与肿瘤多药耐药的形成,故SFRP5蛋白及其信号通路可能作为评估白血病预后的新指标及治疗多药耐药白血病的新靶点,从而提高白血病的治疗缓解率,改善预后。
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