LBH589对人上皮性卵巢癌OVCAR-3细胞增殖的抑制作用及机制探讨

上皮性卵巢癌是妇科恶性程度最高的肿瘤,大多数患者发现时已是晚期,多烯紫杉醇与铂类联合是治疗卵巢癌的金标准,但容易产生耐药5年生存率并无明显提高,为30%左右LBH589是一种新型的HDAC(组蛋自去乙酞化酶)抑制剂,本研究探讨LBH589对上皮性卵巢癌OVCAR-3细胞增殖和凋亡的影响.
    1材料与方法
    1.1材料
    LBH589购自美国Selleck公司,用DMSO配成10mmol/L备用丁RPMI1640、新生小牛血清为Gibco公司产品,MTT为Sigma产品β-tubuliu购自美国Abeam公司,Caspase-3,PARP,Bax,Bcl-2购自美国EpitomicsIrc公司.
    1.2方法
    1.2.1细胞培养OVCAR-3购自美国菌种保藏中心(ATCC)(Rockville,MD,USA)用含10%新生小牛血清、青霉素100IU/mL、链霉素100μg/mL的RP-MI1640培养液,在370C,5%C0,及饱和湿度条件下培养,每2一3天换液传代1次.
    1.2.2细胞抑制率的测定用MTT法检测细胞增殖抑制率,取对数生长期细胞制成单细胞悬液,将2x10个细胞接种于%孔培养板,试验分为阴性对照组和药物试验组,并设未加细胞、只加培养液的空白对照组,每个组设3个复孔、培养24h后分别加人不同浓度的LBH589继续培养48h,加人20μL/孔MTT("5mg/ml),370C孵育4h后,离心1000r/min,10min,弃上清加人DMSO150},L,震荡10min,至紫色结晶完全溶解,选择560nm波长,酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度OD值(A值),以空白对照OD值调零,试验重复3次,计算抑制率(0}0}=1-(试验组A值一空自对照组A值)/(阴性对照组A值一空自对照组A值)x100%.
    1.2.3AO/EB荧光染色取对数生长期细胞制成单细胞悬液,用5x10;个细胞接种于6孔培养板,试验分为阴性对照组和药物试验组,培养24h后加人0.01xnMLBH589继续培养48h,用2.5g/L胰酶消化后离心,用PBS洗后离心弃上清,加入100},Lt1丫陡橙(AO100}.},g/mL)、嗅化乙陡(EB100N,g/mL)混合后滴片,立即用荧光显微镜观察.
    1.2.4Westernblot检测细胞接种和药物浓度与上述相同处理细胞48h后提取蛋白质,BCA方法进行蛋白定量,行10%十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE),转移至硝酸纤维素膜_L,5%脱脂牛奶于37℃温箱内封闭纤维素膜30min,加人一抗处理4℃过夜,第二天与二抗杂交1h后TBS'I'洗涤3次,用WB成像系统及分析图像软件((Image}u}otLAS4000)发光显像检测蛋自表达水平1.3统计学方法应用GraphPaclPrism4.00软件进行(>ne-wavANOVA2结果2.1LBH589对OVCAR-3细胞增殖的影响
    不同浓度(0一10},M)LBH589处理OVCAR-3细胞24,48,72h可明显抑制OVCAR-3细胞增殖,并呈剂量及时间依赖性(图1)-LBH589作用1=OV_CAR-3细胞48h半数抑制浓度(ICS)为0.12},M同时,倒置显微镜下发现,细胞形态发生改变,发生固缩、碎裂,失去贴壁能力,呈现明显的凋亡特征.
    2.2AO/EB染色
    正常对照细胞主要呈细胞核绿色淡染,胞浆桔黄或桔红色,早期凋亡细胞的细胞膜尚完整,胞浆发生固缩,细胞核固缩或碎裂,呈致密浓染的黄绿色,有的还可见碎块状晚期凋亡细胞的胞膜通透性增加,EB能够通过,呈鲜红色固缩体或碎块,坏死细胞为鲜红色的膨大细胞(图2).
    2.3LBH589对0VCAR-3细胞相关凋亡蛋白的影响LBH589作用.VCAR-3细胞48h后,Caspase-3、P;aRP-85kD蛋自表达增加,pro-Caspase-3,PARP-115kD蛋自无明显变化,抗凋亡蛋自Bcl-2表达减少,促凋亡指标Bax蛋白表达增多.
    3讨论
    LBH589是新一代广谱的组蛋白去乙酞化酶(HDAC)抑制剂,在多项体外研究证明LBH589能诱导多发性骨髓瘤、甲状腺癌、乳腺癌细胞的凋亡.
    有的已经进人临床试验ia-s,为了明确LBH589对卵巢癌细胞的抗肿瘤作用,本研究从抑制细胞增殖和促进细胞凋亡两方面观察其对卵巢癌细胞OVCAR-3细胞株的影响.
    细胞增殖与细胞周期的运转有密切的关系,调控细胞周期可以影响细胞增殖C细胞周期的调控异常是肿瘤发生的重要机制.本研究用MTT法检测细胞增殖抑制率,发现LBH589抑制了OVCAR-3细胞的增殖,并随着剂量和时间的增加,抑制率增加.
    LBH589可使细胞周期阻滞于G=/M期,LBH589影响细胞周期进程可能涉及多个细胞周期调控相关蛋白,说明LBH589有较广的抗癌靶点:
    AO/EB染色法从形态上观察LBH589作用OV-CAR-3细胞后凋亡的变化.AO可以透过细胞膜,将细胞核内的DNA染成绿色,胞浆内的RNA呈桔红色.坏死细胞不仅细胞膜不完整,而且线粒体肿胀,为鲜红色的膨大细胞:"-LBH589处理OVCAR-3细胞后可以观察到此变化,说明LBH589作用OV-CAR-3细胞后可以诱导细胞凋亡,且和药物浓度及作用时间呈正相关.
    凋亡信号通路缺陷是许多肿瘤组织的特性,并和肿瘤抗药性相关促进肿瘤细胞凋亡是治疗肿瘤的有效手段.Bcl-2家族是一类调控细胞凋亡的关键蛋白,研究表明,HDAC抑制剂可以通过调控Bcl-2家族蛋白的表达,活化凋亡信号转导通路,进而诱导细胞凋亡a.PARP的剪切通常认为是Caspase-3途径激活的标志,通过Westernblot检测凋亡通路的关键分子发现,LBH589作用OVCAR-3细胞48h后底物PARP-85kD增加,抗凋亡指标Bcl-2蛋白表达减少,促凋亡指标Bax蛋白表达增加:因此,LBH589诱导卵巢癌细胞OVCAR-3发生凋亡的机制主要是通过调控Bcl-2家族蛋白Bax和Bcl-2的表达,激活Caspase-3凋亡通路,进而诱导肿瘤细胞凋亡.
    本研究结果表明,LBH589可以明显抑制卵巢癌细胞OVCAR-3的增殖,与剂量及作用时间呈正相关,通过调节Bcl-2家族蛋白的表达,诱导细胞凋亡,具有抗肿瘤作用,为将来的临床试验和应用提供了实验依据.
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