人牙囊细胞中表皮生长因子的表达以及流体静压力下的改变

作者：金作林　林珠　焦光海　王海雪

【关键词】  人牙囊细胞

　　［摘要］  目的：研究体外培养的人牙囊细胞EGF的表达以及在不同流体静压力作用下对细胞分泌EGF的影响，探讨EGF在牙齿萌出过程中的作用。方法：取年龄为12岁男孩埋藏阻生牙齿的牙囊进行人牙囊细胞培养，将传代的培养细胞应用原位杂交的方法表达EGF，RT-PCR定量分析，分别在50、100 kPa流体静压力作用1 h后RT-PCR方法观察细胞EGF的浓度变化。结果：培养的人牙囊细胞呈梭形，主要为成纤维样细胞，原位杂交染色显示人牙囊细胞中EGF的表达呈阳性，定位于细胞的胞质中，50 kPa流体静压力表达略有增加，100 kPa压力表达明显降低，说明流体静压力在一定力值范围内对人牙囊细胞中有EGF的表达具有空间性。结论：培养的人牙囊细胞具有合成与分泌EGF的能力，流体静压力可以影响体外培养的人牙囊细胞EGF的分泌。

　　［关键词］  人牙囊细胞  表皮生长因子  流体静压力

　　Expression of Epidermal Growth Factor in Cultured Human Dental Follicle Cells and its Changes under Different Hydrostatic Pressures.

　　Jin Zuolin, Lin Zhu, Jiao Guanghai, et al.

　　Department of Orthodontics, Stomatological college, The Fourth Military Medical University, Xi’an 710032

　　［Abstract］Objective: To investigate the expression and localization of epidermal growth factor (EGF) in cultured human dental follicle cells and the secretion of EGF after incubation under different concentrations of hydrostatic pressure. Methods: the expression and localization of EGF in cultured human dental follicle cells was observed in situ hybridization. RT－PCR was used to quantitate the amount of EGF secreted by the cells after incubation under different hydrostatic pressures: 50、100 kPa. Results: The cultured dental follicle cells showed elongate shape, exhibited fibroblastic characteristics. The expression of EGF showed positive in cells. The EGF surrounding the nucleus was heavily stained. RT-PCR demonstrated an increase in the amount of EGF under 50kPa hydrostatic pressures and decrease under 100kPa. Conclusion: The results indicated that EGF was synthesized and secreted by the dental follicle cells, and the amount of EGF secreted was influenced by different hydrostatic pressures.

　　［Key words］  EGF  Human dental follicle cells  Hydrostatic pressure

    表皮生长因子(EGF)是发现最早的生长因子之一，分布于人体多种组织中，生物学效应非常广泛，它对体外培养细胞的增殖刺激作用并不局限于上皮细胞，还可诱导来自中胚层的培养细胞的有丝分裂。本研究应用原位杂交方法表达体外培养牙囊细胞中的表皮生长因子，探讨EGF在牙齿萌出中的作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料  а-MEM培养基（Hyclone公司），TRIZOL(Gibco公司)，逆转录试剂盒（上海生工），Tag Plus DNA聚合酶（上海生工），dNTP (上海生工)，DNA Marker(TaKaRa公司)，ODF mRNA原位杂交检测试剂盒（博士德公司产品），DAB显色试剂盒（博士德公司产品），PCR循环仪（PE9600），电泳仪(Bio-Rad)。

　　1.2  方法

　　1.2.1  人牙囊细胞培养［1］  取因正畸需要拔除的12岁男孩埋藏阻生下颌第三磨牙的牙囊组织，将牙囊组织用剪刀剪碎均匀铺于5 cm的培养皿中，置于CO2孵箱中，3 h后加入少量MEM培养液，12 h后再加入MEM培养液，5 d后更换培养液，以后每3 d更换培养液，15~20 d细胞爬满培养皿，0.25%胰酶消化，按1∶2进行传代。

　　1.2.2  流体静压力作用于牙囊细胞  将培养的第3代人牙囊细胞接种于3块24孔培养板中，每孔细胞1×104，培养3~5 d后，分3组：不加压的对照

　　图1 － 图3  略

　　组、加压50，100 kPa组，加力1 h后进行牙囊细胞EGF的检测。

　　1.2.3  原位杂交检测人牙囊细胞内EGF的表达  牙囊细胞常规原位杂交染色检测EGF，常规RT-PCR定量分析。

　　2  结果

　　2.1  原位杂交染色结果  EGF mRNA阳性信号呈棕色颗粒状主要表达于细胞浆，部分细胞核内也可见到阳性信号。未加力组细胞呈很强的棕褐色反应的EGF mRNA阳性表达信号，见图1；50 kPa组细胞受到压力表现为扁平状，EGF mRNA阳性表达信号略增强，呈黄色或棕色，见图2；100 kPa组细胞变形严重，EGF mRNA阳性表达信号明显减弱，呈淡黄色，见图3。

　　2.2  RT-PCR凝胶成像结果  RT-PCR结果显示EGF的表达，见图4。

　　图4  人牙囊细胞表达EGF及β-actin的RT-PCR电泳结果　略

　　3  讨论

    表皮生长因子是发现最早的生长因子之一，分布于人体多种组织，可以刺激体外培养的上皮细胞以及诱导多数来自中胚层的培养细胞的有丝分裂，包括启动的DNA合成，激活RNA及蛋白质的合成。

    Hoath发现在0~3 d大鼠注射EGF可以有效地促进磨牙的萌出。Lin等体内体外研究表明EGFmRNA均表达于牙囊细胞中［2］，本研究也发现人牙囊细胞表达EGFmRNA。Wise培养大鼠牙囊细胞EGF在0~12 d内一直呈阳性；由于单核细胞是在早期进入牙囊，而EGF受体（EGFR）是在早期的牙囊组织上呈强阳性，所以认为EGF对于牙囊的作用是通过牙囊上的EGFR来实现。另外发现EGF在牙囊组织、造釉器呈阳性，说明内源性的EGF是以自分泌或旁分泌的方式对牙齿萌出进行调节的。研究证明在培养的大鼠的星网层细胞中加入EGF可以增加TGF-β1的表达,由于星网层细胞表面有EGFR存在,所以EGF通过促进TGF-β1合成间接调节牙齿的萌出。Wise［3］在刚出生大鼠体内注射EGF可以增加星网层细胞IL-1 alpha 的表达。在体外 EGF也增加星网层细胞IL-1 alpha 以及IL-1 alpha信使mRNA的表达。而IL-1 alpha 可以趋化单核细胞，所以EGF可能通过促进IL-1 alpha 的合成调节牙齿的萌出。EGF在体内和体外牙囊细胞中可以增加c-fos 的表达，表达具有时间性和量性，而c-fos基因是牙齿萌出的重要因子，可以调节或影响单核细胞分化或单核细胞转化破骨细胞［4］。Shroff［5］研究发现外源性EGF在牙齿萌出中起中性调节因子的作用，EGF and EGFR在牙齿萌出过程中免疫定位于牙囊,牙槽骨和造釉细胞。 RT-PCR发现冠部牙囊表达EGFmRNA 在出生后2，5和9 d，而EGFR则仅出现在第9天，说明牙囊细胞本身就是EGF的靶细胞，可能在牙齿发育和萌出中起重要的作用。

 研究显示流体静压力是影响牙齿萌出的主要机制之一，恒牙胚在牙槽骨中处于一个流体静压力平衡系统中，当恒牙胚所处的流体静压力平衡环境被打破，围绕恒牙胚的牙囊受到流体静压力，将产生一系列形态学、细胞学和生物化学改变，从而对牙齿的萌出起到调节作用。本研究发现流体静压力作用下对人牙囊细胞中EGF的表达有影响，50 kPa压力表达略有增加，100 kPa压力表达明显降低，说明流体静压力对人牙囊细胞中EGF的表达具有空间性，压力较小时对牙囊细胞的活性可能有增强作用，其合成和分泌细胞外基质能力增强，有力促进细胞的功能，压力较大时对牙囊细胞的活性可能有抑制作用，其合成和分泌细胞外基质能力下降，有时可以导致部分细胞坏死，功能降低。有作者认为这些改变是因为压力改变了细胞骨架结构，从而将影响到细胞功能，这种生理性压力将影响到细胞本身以及细胞外基质分泌调节细胞生长的因子，同时细胞形态的改变可能有利于分泌特殊物质的特殊部位的暴露，影响这些物质的分泌。但具体的机制尚需进一步的研究。

    总之，EGF是调节牙齿萌出的重要细胞因子之一，而流体静压力通过影响 EGF细胞因子的活性影响牙齿的萌出。

　　参考文献

　　［1］  金作林，林珠.体外培养人牙囊纤维样细胞［J］.口腔医学研究，2002，18（4）∶236-238

　　［2］  Lin F, Zhao LH, Wise GE. In vivo and in vitro effects of epidermal growth factor on its receptor gene expression in rat dental follicle cells ［J］. Archs Oral Biol.1996, 41(5)∶485-491

　　［3］  Wise GE, Lin F, Zhao L.Immunolocalization of interleukin-1 alpha in rat mandibular molars and its enhancement after in vivo injection of epidermal growth factor ［J］. Cell Tissue Res, 1995, 280(1)∶21-26

　　［4］  Wise GE, Lin ZF. Effects of epidermal growth factor(EGF)and colony stimulating factor-1(CSF-1) on expression of c-fos in rat mandibular molars: implications for tooth eruption ［J］. Cell Tiss Res, 1996, 284∶1-7

　　［5］  Shroff B, Kashner JE, Keyser JD, et al. Epidermal growth factor and epidermal growth factor-receptor expression in the mouse dental follicle during tooth eruption ［J］. Arch Oral Biol, 1996, 41(6)∶613-617
　　
　　基金项目  国家自然科学基金（编号：30400510）

　　作者简介  金作林（1969~ ）， 男，辽宁鞍山人，副教授，博士，主要研究方向为牙周组织重建与牙齿正畸。