血管内皮生长因子受体-1和血管内皮生长因子受体-2在子(癎)前期中的表达及临床意义

子癎前期是妊娠期的一种综合症状，发病率约为5%，在发达国家是母亲和胎儿死亡率居高不下的一个主要的原因。在妊娠20周后，该综合征以高血压和尿蛋白为特点。研究表明促血管生成因子如血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactorreceptor,VEGF)与抗血管内皮生成因子如可溶性血管内皮生长因子受体1(solublevascu-larendothelialgrowthfactorreceptor-1，sVEGFR-1)以及可溶性血管内皮因子的失衡，与子病前期的发病机制密切相关。血管内皮生长因子受体一1(vas-cularendothelialgrowthfactorreceptor-1，VEGFR-1)和血管内皮生长因子受体(vascularendothelialgro=.vthfactorreceptor-2,VEGFR-2)在结构上与酪氨酸激酶受体家族的成员有关，在内皮细胞中可调节关键信号通路。目前，对于VEGFR-1和VEGFR-2在子,前期的表达水平尚不清楚。因此，本研究通过观察子痈前期VEGFR-1和VEGFR-2的表达，探讨其在子,前期的临床检测意义。
1资料与方法
1.1一般资料以本院2011年3月至2011年11月住院子癎前期妇女巧例为观察对象(子病前期组)，选择本院同期住院正常妊娠分娩产妇21例为正常对照组。本次研究的目的、方法和内容等均已告知所有被试者，并签署知情同意书，同时报请院伦理委员会批准。所有产妇均分娩单活胎，两组产妇年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，其余各项指标比较差异均有统计学意义(P<0.O5或P<0.O1)，见表1.
1.2方法
1.2.1 ELISA检测血浆中sVEGFR-1和sVEGFR-2的表达取两组产妇分娩前后的血浆，离心后取血浆标本，用标本稀释液1:1稀释，并取50闪于样本孔内;加人标准品50闪于反应孔;立即加人50闪的生物素标记的抗体，振荡混匀，37℃孵育1h;弃液，洗涤，用吸水纸拍干。重复此操作3次;每孔加人60闪的亲和链酶素一HRP,混匀，37℃孵育30min;弃液，洗涤，用吸水纸拍干。重复此操作3次;每孔加人底物A,B各50闪，混匀，37℃避光孵育10min;取出酶标板，迅速加人50闪终止液;立即在450nm波长处测定各孔的OD值。
1.2.2 RT-PCR检测胎盘组织中VEGFR-1,VEG-FR-2,sVEGFR-1和sVEGFR-2mRNA的表达(1)提取胎盘组织RNA，并检测其纯度和完整性。(2)逐一加人试剂盒提供的试剂及2},g总RNA，反应体系20},I，反应条件:370C60min,950C5min0(3)加人反应试剂、上下游引物及cDNA1闪，反应体积为25p,1，反应条件:950C10s,58℃15s,72℃20s,28个循环。各基因引物序列分别为:GAPDH:上游:5'-AAGCCCATCACCATCTTCCA-3'，下游:5'-CCTGCT-TCACCACCTTCTTG-3'，产物长度为580bp;VEGFR-1:上游:5'-TCCCTTATG.ATGCCAGCAAGT-3'，下游:5'-CCAAAAGCCCCTCTTCCAA-3'，产物长度为312bp;VEGFR-2:上游:5'-CTTGGCCCACAGCCTCTGCC-3'，下游:5'-GTTCCCCTCCATTGGCCCGC-3'，产物长度为225bp;sVEGFR-1:上游:5'-ACAATCAGAGGT-GAGCACTGCAA-3'，下游:5'-TCCGAGCCTGAAAGT-TAGCAA-3'，产物长度为332bp;sVEGFR-2:上游:5'-CTTGGCCCACAGCCTCTGCC-3'，下游:5'-GGCATTCCAACTGCCTCTGCA-3'，产物长度为241bp0(&)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，扫描灰度值，将目的基因灰度值除以内参灰度值，即为胎盘组织目的基因校正后的相对含量。
1.3统计学处理所有样本用SPSS15.0统计软件包进行统计学处理，数据用无士￡表示、正常对照组与子,前期组之间比较采用独立样本c检验，计数资料用才检验，P<0.O5为差异有统计学意义。
2结果
2.1两组产妇分娩前后血浆中sVEGFR-1和sVEGFR-2蛋白水平的比较正常对照组分娩后与分娩前相比，血浆中sVEGFR-1蛋白水平降低(P<0.01，而子病前期组分娩前血浆中sVEGFR-1水平高于正常对照组分娩前(P<0.01)。与分娩前相比，子病前期组分娩后血浆中、VEGFR-1明显降低(P<0.01)，而子病前期组分娩前血浆中sVEGFR-2水平低于正常对照组分娩前水平(P<0.01)。子痈前期组分娩前后血浆中sVEGFR-2表达比较差异无统计学意义(P>0.O5)，见表2.
2.2两组产妇胎盘组织中VEGFR-1和:VEGFR-1mRNA的比较子病前期组胎盘组织中VEGFR-1mRNA相对表达量(1.5510.31)高于正常对照组
胎盘组织中VEGFR-1mRNA相对表达量(0.52士0.09)(t=4.32,P<0.05);子响前期组胎盘组织中sVEGFR-1mRNA相对表达量(0.74士0.09)亦高于正常对照组胎盘组织中sVEGFR-1mRNA相对表达量(0.3610.04)(t=2.78,P<0.05)。见图1,2.
2.3两组产妇胎盘组织中VEGFR-2和sVEGFR-2mRNA的比较与正常对照组胎盘组织中VEGFR-2mRNA相对表达量(0.6710.15)相比，子殉前期组胎盘组织中VEGFR-2mRNA相对表达量(0.78士0.11)差异无统计学意义(P>0.05);子痈前期组胎盘组织中sVEGFR-2mRNA相对表达量(0.43士0.16)低于正常对照组胎盘组织中sVEGFR-2mRNA相对表达量(0.9110.18)(t=4.Os，P<0.01)。见图3,4.
3讨论
子痈前期是妊娠期高血压疾病的五种状况之一，其发病机制包括血管痉挛、内皮细胞激活、升压反应增加、前列腺素和一氧化氮等。其中，内皮细胞激活是当前研究热点，而内皮细胞功能紊乱与VEGF密切相关。目前，对于临床上子病前期的始发阶段，尚未明确VEGFR-1和VEGFR-2表达的变化及其与子'17前期的关系。
VEGF,VEGFR-1和VEGFR-2在妊娠期的胎盘滋养层持续表达〔io7oVEGFR-1的激酶活性比VEGFR-2的激酶活性低一“一。然而，VEGFR-1被认为是一个“诱饵”受体，VEGFR-2主要参与广泛信号级联反应，调节许多内皮细胞功能，包括增殖、迁移和分化uz-osVGFR-1是一种强大的抗血管内皮生成因子，主要表现为抗血管内皮生长因子和抗胎盘生长因子的活性。sVGFR-2是一种免疫激活受体，由内皮细胞表面蛋白水解形成，伴随配体诱导下VEGFR-2的表达，同时，研究表明sVEGFR-2可抗血管内皮细胞生成和淋巴管生长}'4'oVEGF水平与子病前期开始时的严重性有关，而sVEGFR-1和sVEGFR-2与子痈前期的关系尚未明确。
本研究表明，子癎前期组分娩前血浆中sVEG-FR-1水平明显高于正常妊娠组，而其分娩后血浆中sVEGFR-1明显低于分娩前(P<0.01)，提示血浆中sVEGFR-1的水平可能与子病前期的发病机制有关，以sVEGFR-1为治疗靶点，可能是治疗子病前期的新方向。子痈前期组分娩前血浆中sVEGFR-2低于正常对照组(P<0.01)，但子病前期组分娩前后血浆中sVEGFR-2表达比较差异无统计学意义(P>0.OS)，子病前期分娩的新生儿出生体重〔(1442土235)g]显著低于正常对照组仁(3058士313)g，P<0.01]，提示在早期子病前期或孕期间子宫内的生长迟缓时伴有血浆中VEGFR-2的低水平表达，且血浆VEGFR-2浓度的低水平与胎盘中sVEGFR-2mRNA表达减少有关。在产后子病前期患者中，笔者观察发现产妇胎盘娩出后，血浆中VEGFR-1迅速恢复正常，而血浆中VEGFR-2的水平在分娩前Sd持续处于较低水平，这提示无论是胎盘VEGFR-2表达的降低，还是母源性内皮细胞功能紊乱，都可能会影响子响前期患者血浆中VEGFR-2的水平。
本研究结果还显示，子癎前期患者胎盘中VEGFR-2mRNA的表达与正常妊娠妇女一致。子病前期患者血浆中低水平的VEGFR-2同样反映内皮细胞较差的再生能力。子痈前期伴有内皮细胞的功能障碍，其特征是内皮细胞增加介导的血管收缩，增加血管通透性和血小板的聚集，而这些效应可能导致孕妇产生高血压和蛋白尿。对于有先兆子癎病史的女性，其内皮细胞损伤会增加患心血管疾病的风险，因此笔者认为早期针对与内皮细胞损伤有关的VEGFR-1和VEGFR-2进行靶向治疗，可能有利于这类患者的预后。
总之，本研究表明血浆中抗血管生成因子特别是VEGFR-1和VEGFR-2在子病患者产后早期展现出不同的表达变化，持续低水平表达的VEGFR-2伴随VEGFR-1的表达快速下降，表明VEGFR-1可能与子病前期有关，而在子痈前期患者血浆中sVEG-FR-2的持续低水平可作为判断内皮细胞功能紊乱的标志，同时，以VEGFR-1和VEGFR-2靶点，可作为临床治疗子响前期的新手段。
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