卵巢癌个体性化疗方案制定的实验研究

卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤之一,严重威胁妇女健康。卵巢癌的治疗除化疗、手术治疗、放疗外,还包括其他的基因治疗Ell、血管生成抑制剂治疗[2]、调控细胞信号转导[3]以及免疫治疗等,但疗效尚不确切。化疗无疑在卵巢癌的治疗中具有举足轻重的地位,近10年来,铂类药物联合紫杉醇成为治疗卵巢癌的标准一线化疗方案。但多数卵巢癌患者仍会复发,其主要原因是化疗过程中卵巢癌细胞对化疗药物的多药耐药性。卵巢癌的多药耐药性是化疗药诱导卵巢癌细胞凋亡受阻抑的结果,因此进行卵巢癌细胞凋亡的体外药敏研究成为卵巢癌患者个体性化疗的希望。本研究通过对人卵巢癌细胞系HO-8910及人黑色素瘤细胞株肛375进行体外药敏实验,首先采用MTT法在细胞抑制率的基础上优选出相应的抗癌药物,再采用FCM法通过细胞凋亡率评价抗癌药物的优化组合方案,旨在为临床卵巢癌患者个体化疗方案的制定提供一个有用的研究模式。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1细胞株HO8910细胞系购于中国科学院上海细胞库,人黑色素瘤细胞株A375由遵义医学院附属医院皮肤科教研室赠送。

1.1.2药品、试剂胎牛血清、RPMI164o培养基购于GIBICO公司,MTT试剂、DMSO购于SIG—MA公司,化疗药物BLM、奥沙利铂、CDDP、紫杉醇、5Fu、MTX、VCR、A助O3均购于遵义医学院附属医学院药剂科,胰蛋白酶1:250购于北京华美试剂公司。使用时新鲜配制,使最终浓度分别为1/4、1/2、1、4、10、20倍PPC;参照体外药敏实验相关文献中化疗药物工作浓度的选择,以PPC作为药物工作浓度的基础,用生理盐水配制成50PPC的母液,置于一⒛C冰箱中保存[刽。用合成培养液将其稀释至1/4、1/2、1、4、10、⒛倍PPC。联合用药时浓度:BLM4PPC(o.786ug/mL);奥沙利铂4PPC(0.544ug/mL);CDDP4PPC(32ug/mL);紫杉醇4PPC(216ug/mL);5—Fu1/2PPC(40ug/mL);MTX 2PPC(26 ug/mL);VCR 4PPC(0.12ug/mL);A助034PPC(1.2ug/mL)。

1.2方法

1.2.1细胞培养人卵巢癌细胞系HO8910细胞、人黑色素瘤细胞株A375细胞均用含lO0mL/I'的胎牛血清RPMn64o培养液,在37C、体积分数5%CO2条件下培养。

1.2.2形态学观察浓度为5×10饪/mL的HO 8910细胞悬液分别接种于6孔培养板中,每孔5mL,过夜贴壁,第2d更换培养液,加人化疗药物培养48h,倒置显微镜下观察。

1.2.3细胞生长抑制率的测定取对数生长期HO8910细胞及A375细胞,接种于96孔培养板中,每孔加人不同浓度的化疗药物,空自对照组加等体积不含药物培养液,每组设5个平行孔,每种药物接种3板,此后分别在加药后24、48、72h取出,每孔加人5g/I'MTT10uL,继续培养4h,吸去培养液,加入二甲基亚砜100uL,微震荡后,用酶标仪在490nm波长下测光吸收值(A),按公式计算细胞抑制率:细胞抑制率(%)=(1一实验组平均光密度A值/对照组平均光密度A值)×100%E5]。重复3次取其平均值,筛选出敏感的化疗药物浓度(细胞生长抑制率:>70%,敏感;50%~7o%,中度敏感;(50%,耐药)[6]。

1.2.4流式细胞术收集上述所得细胞生长抑制率最高的化疗药物组合,将其作用48h的细胞,磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffer抛line,PBs)洗涤后用4C700mL/L乙醇固定12h以上,经离心去乙醇,碘化丙啶染色30min后上机检测,每组重复3次。计算细胞凋亡率AP:AP(%)=(凋亡细胞数/检测细胞总数)×100%E7]。

1.3统计学方法采用SPSS11.5统计学软件,实验组数据歹±s表示,进行￠检验。多样本均数比较采用单因素方差分析,两组均数比较采用成组设计r检验。分析时间浓度效应应用析因设计的方差分析。检验水准α==0,05。

2结果

2.1形态学改变H08910细胞呈长梭形,均贴壁生长,轮廓清楚,形态饱满,胞质丰富,生长旺盛。化疗药物处理后,贴壁的正常细胞数逐渐减少,细胞间质变大,部分细胞体积缩小,胞浆中出现颗粒沉积,遮光性减弱,随时间延长,脱落漂浮的细胞增多,可见坏死细胞及碎片。CDDP+BLM+紫杉醇作用10h、48h后形态学变化见图1。

2.2化疗药物单用对细胞的生长抑制作用MTT结果为3次实验平均值。不同浓度化疗药物作用⒛、48、72h后,各用药组光吸收值均明显低于空白对照组,差异有统计学意义(P(0.05)。相同浓度顺铂(CDDP)作用48h后,两种细胞抑制率不同,H⒍8910细胞抑制率高,两组相比差异有显著性(P(0.05),见表1。相同浓度的其他化疗药物作用两种细胞相同时间后,细胞抑制率差异无统计学意义(P)0.05)。在同一药物浓度作用下,细胞抑制率随作用时间的延长有增加趋势;化疗药物对两种细胞的抑制作用随浓度增加而增强。当浓度达到一定程度时,抑制作用已接近最大,继续增加浓度,抑制率并无明显增加。用光吸收值作析因分析得出化疗药物浓度与时间存在交互作用(P<0.05)。

2.3联合用药对细胞生长抑制作用联用药物组合的细胞生长抑制率随时间延长而增加,与对照组吸光值比较,CDDP+BLM+紫杉醇抑制作用更强(P(0.01),联合用药组与相应单一用药组相比细胞抑制率差异有显著性。见表2、表3。2,4 CDDP+BLM+紫杉醇化疗药物联合作用的HO8910细胞凋亡率(AP)CDDP+BLM+紫杉醇对HfD8910细胞的抑制作用并不完全随时间延长而增加,由FCM散点图与图表得到结果如下:实验组的AP在CDDP+BLM+紫杉醇作用2~4h之间上升,作用4h时AP值达第一个峰值(38.89%),在6h开始下降,8~10h之间迅速下降,作用12~48h之间AP直线上升,作用48h时AP值达第二个峰值(75.70%),此峰值高于4h时;而对照组的AP值在同等条仵培养4h时开始卞降,48h时AP值下降至最低为2.7%。故实验组与对照组的AP变化有差异,4h时差异显著(P=0,145),48h时差异最显著(P=0,o136)。见图2、图3及表4。

3讨论

3.1卵巢癌细胞的化疗敏感性与化疗药诱导的卵巢癌细胞凋亡已有研究[H21表明,卵巢癌化疗主要通过诱导癌细胞凋亡实现,癌细胞凋亡受抑制是卵巢癌多药耐药的原因。因此卵巢癌细胞的化疗敏感性取决于化疗药诱导卵巢癌细胞凋亡的程度。近5年来,设法诱导卵巢癌细胞凋亡成为新的化疗目标,细胞凋亡程度成为评估疗效的一项新指标E13]。本研究采用MTT法和FCM法分别检测细胞抑制率、早期细胞凋亡、晚期细胞凋亡和细胞凋亡率,结果发现卵巢癌细胞的化疗敏感性与化疗药诱导的卵巢癌细胞凋亡密切相关。

3.2人卵巢癌个体性化疗方案的指标体系

3.2.1细胞抑制率本研究通过MTT法检测细胞抑制率。由于MTT法快速简便,不需特殊设各,可同时进行大量样本的取样分析,能反映肿瘤群体细胞与药物的关系,故自建立至今,已被广泛应用于抗肿瘤药物研究,并于1991年被美国Nα纳人抗癌药物筛选程序X41。但MTT法存在显色干扰、甲腊颜色维持时间短及结晶溶解度差等影响因素,故其检测结果存在假阳性可能。因此,本研究仅以MTT法检测的结果作为筛选敏感化疗药物及其组合的基础。MTT法检测结果显示,4PPC的CDDP单用时对H08910细胞的抑制率最高,为80.43%,将其与2PPC的BLM、4PPC的紫杉醇联用时,该组合的细胞抑制率达到94,44%,为所有药物组合中抑制率最高者,与对照组比较差异显著(P=0.0125)。因此,本研究结果证明,联合用药的效果优于单一用药。本研究发现,4PPC的As203对HO-8910细胞的增殖具有明显的抑制作用,细胞抑制率为73.37%,与对照组比较差异显著。但这种抑制作用并不具有时间和剂量依赖性,推测这可能与不同浓度A助O3诱导癌细胞凋亡的方式不同有关。

3.2.2早期细胞凋亡根据Ca2+依赖的磷脂结合蛋白Amexin V能高亲和结合PS(磷脂酞丝氨酸)的原理,将AnnexiⅡV作为检测细胞表面PS的敏感探针,用于细胞凋亡早期的检测。同时使用膜非通透性DNA染料PI则能从Annexill V染色的细胞中将凋亡和坏死细胞区别开来,即Annexin V+/PIˉ为凋亡细胞;Anne姑⒈V+/PI+为坏死细胞。本研究结果显示,CDDP+BLM+紫杉醇诱导早期细胞凋亡的效应依次为4h、2h、6h、8h、10h。早期凋亡细胞集中在4h,4h后早期凋亡细胞数逐渐减少,而坏死细胞和晚期凋亡细胞数逐步增加。结果表明该组合诱导卵巢癌细胞系Ho-8910早期凋亡的时间出现在2~4h,随后进人晚期凋亡。

3.2.3晚期细胞凋亡根据核酸内切酶被激活,使DNA断裂成50~300kb的片段,最终特异性地降解成为180~⒛0bp的片段的原理,将经甲醛固定后的细胞加人外源性的TdT和X dUTP孵育一定时间,通过TdT介导X dUTP作为DNA断裂处3OH末端掺入的引物,并被X dUTP所标记,再通过FCM的荧光标记FITC dUTP,经FCM检测DNA碎片,并将晚期凋亡细胞与坏死细胞区分开来。本研究结果显示,CDDP+BLM+紫杉醇诱导晚期细胞凋亡的效应依次为48h、4h、12h。从12 h开始M2逐步增加,至48hM2达到75.70%。结果表明该组合诱导卵巢癌细胞系Ho8910晚期凋亡的效应呈时间依赖性,在4βh诱导癌细胞晚期凋亡的效应最显著。

3.2.4细胞凋亡率AP值根据细胞凋亡率的计算公式和评价方法,结果显示CDDP+BLM+紫杉醇诱导早期细胞凋亡在4h时AP值达最高,为38.89%,与对照组比较差异显著(P=0.0145),因此该组合作用4h时以诱导卵巢癌细胞凋亡为主。CDDP+BLM+紫杉醇诱导晚期细胞凋亡在48h时AP值达最高,为75.70%,与对照组比较差异显著(P=0.0136),因此该组合作用48h时以诱导卵巢癌细胞凋亡为主。结果表明该组合对HO-8910细胞系的作用以诱导细胞凋亡为主,并呈时间依赖性。

3.3人卵巢癌个体性化疗方案的制定程序

FCM法检测细胞凋亡具有敏感度高、特异性好等优点,因此,通过FCM法检测细胞凋亡成为卵巢癌体外药敏研究的热点。本实验在细胞抑制率的基础上优选出相应的:抗癌药物,再通过细鹛凋亡率评价抗癌药物的优化组合方案,结果发现,在细胞抑制率的基础上优选出相应的抗癌药物,再通过细胞凋亡率评价抗癌药物的优化组合方案,这一肿瘤个体性化疗方案制定程序具有可行性,为其他肿瘤患者个体化疗方案的制定提供了一个有用的研究模式。

参考文献

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