卵巢癌组织中凋亡相关蛋白8的检测及其临床意义

肿瘤严重威胁人类的健康和生命,其中卵巢癌是严重威胁妇女健康的恶性肿瘤,其病死率约占妇科肿瘤的仰%,为妇科肿瘤的首要死亡原因,流行病学统计显示其发病呈现逐年增加和年轻化的趋势,已成为危害公共卫生健康的一个严重问题。卵巢癌的发病机制目前仍不清楚,故而也缺乏有效的防治方法,卵巢癌的发病部位较为隐匿,难以早期发现,同时肿瘤的异质性也会导致临床病理分期在预后评估方面有一定的局限性,因此明确卵巢癌相关的致病基因,以利于卵巢癌的早期诊断和预后判断是一个急需解决的问题囵。凋亡相关蛋白8(THAR8)是新近发现的凋亡相关蛋白家族成员,研究显示其广泛参与了细胞增殖、细胞周期、染色体修饰重构以及转录调控等重要生命活动,并且在多种实体肿瘤中表达异常,属于抑癌基因家族成员四。本研究检测卵巢癌组织中THAP¨8的表达情况,以探讨其与卵巢癌的关系及相关的临床意义。

资料与方法

1.一般资料:收集我院妇科2010年10月至2012年6月收治的卵巢癌患者陌例,所有患者均经病理检查确诊为卵巢癌,年龄32~70(51.4±12.8)岁,分别取卵巢癌组织每例另取癌旁50px处非癌卵巢组织作为对照,癌旁组织也经病理检查证实。临床TNM分期:I期16例,Ⅱ期乃例,Ⅲ期20例,Ⅳ期21例。所有患者术前均未行放化疗或其他相关治疗。

2.试剂和仪器:%zol、反转录试剂盒、sYBR Green Red time-聚合酶链反应(PCR)试剂盒购自大连宝生物科技有限公司,THAP-8mRNA引物由深圳华大基因有限公司合成,THAP-8免疫组织化学试剂盒购自美国RD公司,叨00PCR仪和,O00荧光定量PCR仪均购自美国ABI公司。

3.THAP-8基因表达量检测:THAR8mRNA表达量使用荧光定量PCR法,操作方法:取sO mg组织液氮研磨,加人1ml T饨ol,按照%zol试剂盒说明书操作提取细胞总RNA,参照反转录试剂盒说明书反转录出cDNA第一条链,参照Red time2CR试剂盒说明书0.21·11EP管申加人cDNA模板、引物、荧光染料。THAP-8基因勿序为5LTCTGCAGCGCCTGACAACAG-3i(sence)和51-TGTCCAGGAGTCCGGCTTG-3a,内参照GAPDH基因引物序列为GAIIIGGTCGTA叨℃GG-3t(sence)和日51-GGAAGATGGTGATGGGATT-3。匆-增反应条件为舛℃预变性3min,扩增35个循环,最后”℃延伸5min。α=THAP-8基因Ct-内参GAPDH基因α,THAP-8基因的表达量采用⒉Act评估。

4.THAP-8蛋白表达量检测:THAP-8蛋白表达量检测使用免疫组织化学法,严格按照免疫组织化学试剂盒的说明书操作,制作石蜡切片,加人1△00稀释的THAP-8抗体,湿盒4℃过夜,PBS冲洗,二抗,室温继续孵育30m血,PBs冲洗后DAB显色,苏木精复染,中性树胶封固,镜下观察。结果判断:阳性结果为细胞质和细胞膜内出现棕黄色或浅黄色颗粒。每片选5个视野,图像分析系统(IMAGE-PRO6.2,美国)进行图像分析,测定相应积分吸光度(IOD)值,计算平均值表示相应蛋自的表达量。

5.统计学方法:应用sPss120软件进行统计分析,计量资料比较采用J检验,P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1.THAP-8基因和蛋白在卵巢癌组织与癌旁组织中的表达比较:卵巢癌组织中THAR8基因和蛋白表达量均显著低于癌旁组织,差异有统计学意义(P(0,01)。见表1。

2.卵巢癌组织啦THAP-8基因和蛋白表达量与临床病理指标的关系:见表2。高分化卵巢癌组织中THAP-8基因和蛋白表达量显著高于中、低分化卵巢癌组织,有淋巴结转移卵巢癌组织中THAP8基因和蛋白表达量显著低于无淋巴结转移卵巢癌组织,临床分期I、Ⅱ期卵巢癌组织中THAP-8基因和蛋白表达量显著高于临床分期Ⅲ、Ⅳ期卵巢癌组织,差异均有统计学意义(P<0,01或<0.O5)。

讨论

卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,研究卵巢癌的发病机制,明确其相关致病基因,有利于卵巢癌的早期诊断和预后判断囹。肿瘤的发生、发展是一个逐步的多阶段过程,其中癌基因的激活或抑癌基因的失活参与了肿瘤的发生、发展过程囵,THAP-8是新发现的一个抑癌基因,与凋亡相关蛋白家族其他成员一样具有N端的⒆个氨基酸保守序列,紧邻保守序列的是一段锌指结构,此结构可以发挥转录因子的作用调控下游靶基因的表达,完成负性调控细胞增殖的生物学活性m,进一步的研究显示THAR8在人类的多种肿瘤中异常表达网,本研究显示卵巢癌组织中THAP-8基因的表达量显著低于癌旁组织,提示了THAR8基因的失活可能参与了卵巢癌的发生过程。THAP-8基因调控细胞增殖的机制主要是其可以与p58IPK蛋白相互作用,解除了Ⅱ8IPK蛋白对PKR的抑制,激活的PKR可以进一步磷酸化eIF~2A转录因子,eIF9A蛋白的磷酸化加速了该蛋白的降解,导致细胞蛋白合成受阻,细胞的分裂增殖受到抑制,另外THAR8还可以作为分子伴侣协同促凋亡激酶MsT1、肿瘤坏死因子α和干扰素γ的作用,以及抑制NF-κB信号通路干扰细胞周期的正常过渡p瑚。本研究显示THAP-8基因表达量在卵巢癌组织中随着肿瘤分化程度的增高、淋巴结的转移以及临床分期的进展呈逐渐减少的趋势,提示THAP-8基因表达量的检测在卵巢癌的恶性程度判定上是一个敏感指标,且可以作为评估患者预后的一个指标。THAP¨8基因在卵巢癌中表达下调的机制,以及其所影响的下游靶基因都还有待进一步的研究来探明。综上所述,本研究显示THAR8基因的失活参与了卵巢癌的发生、发展,可以作为评估患者肿瘤分级和预后的一个指标。

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