Activin A与子宫内膜异位症的相关性研究

糖尿病是一组以高血糖为特征的内分泌代谢疾病，主要为因胰岛素绝对或相对不足和靶细胞对胰岛素的敏感性降低所引起的代谢紊乱。日前，糖尿病已成为严重威胁人类健康的常见疾病之一。 胰岛素替代治疗是目前治疗糖尿病的常用方法，然而长期定时注射胰岛素给患者带来许多不便和痛苦，并可引发多种严重并发症。2000年，Edmonton 小组[1]报道了胰岛细胞移植技术成功应用于临床自此，胰岛细胞移植技术逐渐开展起来。由于受到移植的胰岛细胞数量及免疫排斥反应等因素的影响，治疗效果尚不理想[2]。因此，如何早期进行无创的胰岛细胞移植监测是目前R}待解决的难题。 通过检测血葡萄糖,C反应蛋白以及第一时相胰岛素分泌等是监测移植胰岛细胞功能状况的间接手段[3]，然而，这些指标不能反映早期移植胰岛细胞的功能、存活以及免疫排斥反应的发生。

近年来，随着核素显像技术的迅速发展，可在早期对活体进行无创监测。其中放射性核素报告基因显像在生物医学领域具有独特的应用价值。日前，介导报告基因显像的病毒载体有腺病毒、慢病毒和反转录病毒等。其中杆状病毒是一种新型的基因载体，具有无细胞毒性、载体容量大(38 kb)、不随机插人细胞染色体内而引发细胞突变等特点[4]。我们前期进行了重组报告基因杆状病毒感染肿瘤细胞(滤泡状甲状腺癌细胞株FTC-133)的体外研究51，结果显示重组钠碘同向转运体(sodium iodide symporter, NIS)基因杆状病毒可有效进行目的基因表达的检测。因此，有必要进一步探讨杆状病毒载体介导报告基因是否可有效进行胰岛细胞的监测。本研究通过重组杆状病毒感染大鼠的胰岛细胞，为无创监测胰岛细胞移植进行有益的探索。

材料与方法

1.1重组NIS基因杆状病毒质粒pFBNIS的构建 重组NIS基因杆状病毒质粒pFBNIS的构建方法参见文献报道[5]。简单描述如下:杆状病毒载体 pFBGFPR(香港大学分子生物学研究所惠赠)以限制性内切酶Acc I和Age I ( New England Biolabs)酶切，后以Klenow补平;重组质粒pcDNA-NIS ( Sissy Jhiang 教授惠赠，Ohio University，美国)以限制性内切酶 EcoR I ( New England Biolabs)酶切，酶切后NIS基因片段两侧薪性末端以Klenow补平。分别进行纯化，得到NIS基因片段与去磷酸基的pFB载体用T4噬菌 体DNA连接酶(New England Biolabs )连接后转导 DHSn感受态菌(仁海大根化工有限公司)，涂Amp十 I,B ( in vitrogen培养板初筛，挑选白色克隆，测序证实目的基因片段连接正确后，扩增，抽提重组pFBNIS 质粒DNA〕

1.2重组基因杆状病毒的制备及扩增 对重组NIS慕因及重组绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因本杆状病毒(Bac-NIS和Ba〔一 CF川进行制备和扩增重组杆状病毒质粒pFBGFPR 及构建好的pFBNIS转导DH 10( Invitrogen感受态菌，37℃培养24-48h后挑取转座成功的自色单克隆提取Bacmid质粒，通过脂质体法转染秋豁虫细胞Sf9中国科学院昆虫研究所)。5一6d后收集细胞土_清，空斑实验测定病毒滴度。扩增病毒:以感染复数(multiplicity of Infection , MOI)为0. 1接种Sf9 细胞，6一 7d后收集_r_清液。4℃下500 x g离心 20 min，收集上清，弃沉淀，直径0. 45 p,m滤器( Millex- GP)过滤,4℃避光保存。空斑试验检测重组杆状病毒滴度，约为5 x 109。

1.3胰岛细胞的分离、纯化、培养、鉴定及计数

1.3.1动物来源SPF级SD大鼠，雄性，体质量220- 260 g购自上海实验动物资源中心(西普尔一必凯公司)，功物生产许可证号码为SCXK(沪)2003 - 0002，使用许可证号码为SCNK(沪)2003一0026 1.3.2细胞分离和纯化①分离:SD大鼠经1 %戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，注射剂量为40 mg/kg}沿腹中线开腹，于卜二指肠开口处夹闭胆总管，近端分离胆总管，将PE管(Anilab)逆行插人胆总管后用乎术线固定。然后剪开胸腔，剪破心脏使大鼠碎死用10 mL注射器通过PE管缓缓注人预冷的浓度为 0. 5 mg/mL的胶原酶P(Roche)8一10 mL，待胰尾胰体部充盈完全后拔出PE管，扎紧胆总管，迅速分离胰腺。将充盈的胰腺放人含6 mL Hanks液(Gibco) 的50 mL离心管(Corning)中，置于37℃恒水浴箱 (上海跃进医疗器械有限公司)水浴巧min .②纯化:水浴后取出离心管震荡，胰腺组织变成细沙状，迅速加人10 mL冰的牛血清，混匀，补足冰Hanks液 50 mL，然后4℃低温低速离心机(Heracus)1 000 r/min 离心1 min。弃上清，重复2次;加冰Hannks液，混匀，通过30目不锈钢细胞筛缓慢过滤，冰Hanks’液补足50 mL,l 000 r/min离心3 min。弃上清液，吸净离心管周围残留液体，加人250 N.,L BSA ( Gib'co ) ,混匀。加人不连续密度梯度液25%的Fico11400 ( GE ) 4 mL混匀，沿管壁依次缓慢加人密度为23% ,20%和 11%的Fico11400和Hanks液各2 mL，水平转子离心机(上海安亭仪器公司)2 000 r/min离心I S min。离心后，吸取23%一20%及20%一11%液面层的胰岛细胞于I5 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min。弃上清，加人冰Hanks液，棍匀，移人10 mL培养皿中，体式显微镜下挑取胰岛细胞。灌注、洗涤及纯化过程中温度均控制在4℃。 1.3.3细胞培养、鉴定和计数分离的胰岛细胞置于含10% FB家1%青链霉素的RPMI1640培养液中， 37 0C ,5% CO2培养箱(Heraeus)内培养。将10 nla 双硫踪(DTZ, Gibco)溶于10 mL DiVISO，用Hanks液 (PH 7.8)按1:100稀释,0.22 umol/1孔径过滤器过滤，与胰岛制备物混合，室温放置10 min后镜检。鉴定:胰岛细胞经DTZ染色后呈猩红色，其他细胞不着色。计数:直径为150 O m的胰岛细胞记为1个IEQ , 每个IEQ大约含2 000个细胞.

1.4 Bac-GFP感染胰岛细胞后的相关检测 .

1.4.1不同MOI的Bac-GFP对胰岛细胞感染百分比的影响将新分离纯化的胰5细胞以200 IEQ/孔接种于24孔板(COrning}，分别加人MOI为0,10, 20 ,40的Bac-GFP，后加入含11. 1 mmol/L葡萄糖 (仁海生工生物工程股份有限公司)，10%灭活的 FBS,1%青链霉素的P.PMI1640培养液补足500 }L, 37 0C ,5% C02培养箱孵育4h，吸出培养液，1 x PBS 洗两遍，分另of加入500uL含10 % FBS , l%青链霉素的RP1MI1640挤养液，继续孵育，每组设3个复孔。 24 h后倒置荧光显微镜观察GFP表达情况蓝光激发波长488 nm，检测波长520 nm。由于胰岛细胞通常以细胞团的形式存在，因此，我们将表达荧光的胰岛细胞数占胰岛细胞总数的百分比定义为胰岛细胞感染百分比。 1.4.2 Bac-GFP感染胰岛细胞的荧光表达时间和生存活力测定将新分离纯化的胰岛细胞以200 IF;Q/ 孔接种于24孔板，分别加人MOI为0,40的Bac- GFP，用含10 070灭活FBS培养液补足500 }L0 37℃ 孵育4h，弃上清液，1 x PBS洗两遍，加人500 O,L含 10% FBS培养液继续孵育，每组设3个复孔。分别于 12 h和1,2,5,7,14 d后在倒置荧光显微镜下观察GFP表达情况及细胞的生存状态，蓝光激发波长 488 nm，检测波长520 nm . 1.5 Bac-NIS感染胰岛细胞后的相关检测 1.5.1不同MOI的Bac-NIS对感染胰岛细胞摄碘 的影响将新分离纯化的胰岛细胞!.} 200 IEQ/孔接种于24孔板，分别加人MOI为0}空自对照),5,10, 20 ,40的Bac-NlS后，以含糖及灭活的FBS培养液补足500 p,I，孵育4h后弃上清液，1 x PBS洗两遍，加人500 p,L含FBS但不含糖的培养液继续孵育，每组设3个复孔。24 h后用bHBSS ( HBSS溶液用 IIEPES液调至pH为7. 3)洗2次，每孔加人0. 5 mL 含有3. 7 B q N a125I(上海欣科公司)和1 umol/L NaI 的bHBSS,孵育30 min，冷bHBSS洗3次后加人 0. 5 ml冰的NaOH孵育15 min。吸取NaOH于离心管内，通过井3yJ，计数器(上海日环公司)测定每分钟放射性计数(counts per minute,CPM) . 1.5.2感染的胰岛细胞摄125 I的动态测定将新分离纯化的胰岛细胞以200 I EQ/孔接种于24孔板加人MOI为0(空白对照),40的 Bac-NIS，培养液补足500 p,L,孵育4h后弃上清液，1 x PBS洗两遍，加人500闪培养液继续孵育，每组设3个复孔。 24 h后细胞用pH调整后的bHBSS洗2次，每孔加人 0. 5 niL含有3. 7 Bq Na125I和1 N,mol/I, NaI的bHBSS, 37℃分别孵育15,30,60,120 min，冷bHBSS洗3次后加人0. 5 mL冷NaOH孵育巧15min，吸取NaOH于离心管内，通过井型y计数器测定C P'VI 1.6高氯酸钠(NaC104)刘一感染细胞摄碘的抑制实验 将新分离纯化的胰岛细胞以200 IFQ/孔接种于 24孔板，分别加人NI01为0 ,40的Bac-N IS，然后加人含糖及灭活FBS培养液补足500 },L孵育4h后弃上清液，1 x PBS洗两遍，加人500 O,L培养液过夜孵育。 24 h后细胞用pH调整后的bHBSS洗2次，每孔加入 0. 5 mL含有3. 7 Bq Na125I和1 N.,mol/L NaI的bHBSS , 抑制组NaC10、的浓度分别为0(空白刘一照)}30 N.,mol/L, 37℃孵育15 min。冰bHBSS洗3次，分别加人 0. 5 mI冰冷的NaOH孵育15 min。每组设3个复孔，吸取NaOH于离心管内，通过井型丫计数器测定 CPM_ 1.7统计学方法 采用GraphPad Prism 5. 0l软件进行统计学分析。所有数据以x士S表示，组间比较采用单向方差分析和 Student's T检验，P < 0. 05表明差异有统计学意义。

2结果

2.1胰岛细胞分离纯化后的鉴定， DTZ染色光学显微镜观察发现细胞红染(图1) 提示分离纯化的细胞为胰岛细胞。

2.2不同MOI的Bac-GFP对胰岛细胞感染百分比和荧光表达强度的影响 以不同M01的Bac-GFP感染胰岛细胞后，通过光镜及荧光显微镜观察可见，每个视野中多数细胞显示绿色荧光，且每个胰岛细胞内均可见多个荧光表达(图2)。随着MOI的提高，胰岛细胞感染百分比逐渐升高;MOI为40时，Bac-GFP感染细胞的百分比可高达95%左右。荧光显微镜观察可见感染的胰岛细胞的荧光表达强度同样随MOI的提高而增强。

2.3 Bac-GFP感染对胰岛细胞生存状态的影响 观察发现:在感染后不同时间点，Bac-GFF'感染 (MOI=40)与空白对照胰岛细胞的状态未见明显差异，提示重组杆状病毒对胰岛细胞无明显细胞毒性。另外，感染3d后，感染(MOI =40)与空白对照细胞团均可见散开迹象，细胞内颜色变黑;感染7d后，均可见约有40%的胰岛细胞团完整。

2.4 Bac-GFP感染胰岛细胞的荧光表达时间 不同时间点的观察发现:Bac-GFP感染的咦岛细胞(M01 =40)在感染12 h后细胞开始表达荧光感染后24 h时荧光强度最高，7d时一细胞荧光表达明显降低，部分细胞中央颜色变深变暗，14d时荧光表达微弱，几乎看不到荧光(图3)空白对照( MOI =0 ) 则在不同时间点均未见胰岛细胞有荧光表达

2.5不同MOI的Bac-NIS感染对胰岛细胞摄碘的影响 Bac-NIS感染胰岛细胞的摄碘能力随着MOI的提高而增强。当MOI = 40时一，细胞对放射性125I的摄取约为空自对照的12倍，差异具有统计学意义 (P<0. 01)(图4)

2.6胰岛细胞摄'Z'I的动态测定 Bac-NIS感染胰岛细胞后不同时间点测定感染细胞摄取25 I的CPbT结果显示:感染细胞对25 I的摄取随时间的延长逐渐增加，感染后60 min达高峰，随后细胞内摄取的25 I逐渐排出，C PM逐渐减少，15 120 min内感染的细胞仍维持较高的CPM(图5). 表明Bac-NIS感染的胰岛细胞表达的NIS蛋白具有摄碘的功能，但由于胰岛细胞不具有甲状腺细胞的功能，不能有效地进行碘的有机化及储存，因此，胰岛细胞摄取的125 I不能有效滞留.

2.7 NaG1O4对Bac-N'IS感染胰岛细胞摄碘的抑制作用 Bac-N fS感染胰岛细胞后，当加人NaG1O4、浓度为 30umol/L时，感染细胞125 I摄取率较空白对照明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01}(图6)。表明感染Bac-NIS胰岛细胞的碘摄取可被Na+ -K } -ATP 酶抑制剂NaG1O4、所抑制，即感染的胰岛细胞表达的 NIS具有被NaG1O4,抑制的特性.

3讨论

糖尿病大多是由于自体免疫性疾病或对胰岛索不敏感造成胰岛素产生绝对或相对小足日前，糖尿病治疗主要通过胰岛素及胰岛素类药物，然而该替代治疗很难使机体完全恢复到代谢稳定状态，最终导致微血管和大血管井发症的发生，以及低血糖等不良反应。 胰岛细胞移植治疗操作简单、安全，可以有效控制血糖，防止和减缓糖尿病并发症的发生。特别是 Edmonton力一案的实施，大大改善了胰岛细胞移植的疗效’，给糖尿病治愈带来了新希望。而如何在活体条件下，无创、动态地监测移植的胰岛细胞的分布、存活、移行等是目前胰岛细胞移植检测亟待解决的问题 核素分子显像技术发展迅速，具有灵敏度高、特异性强的特点)特别是放射性核素报告基因显像作为一种问接、无创的显像方法，通过检测报告基因的表达来显示移植细胞的移行、分布和存活，实现刘一移植细胞的以盆测和评估。

日前介导报告基因的载体通常有腺病毒、慢病毒及反转录病毒等。腺病毒及腺相关病毒感染效率高，小整介人染色体，但易导致宿主的免疫反应[6]; 慢病毒可整合到宿主细胞染色体，在细胞中长期表达，但由于其随机插人目的细胞基因组，有可能导致靶基因组表达的改变及产生致瘤性[7]反转录病毒载体宿主范围广泛，能将外源基因随机整合到宿主细胞的基因组中，使之在宿主细胞中稳定存在，但包装容量小，只能感染分裂期细胞[8] 重组杆状病毒是一种新型的基因载体，无细胞毒性，载体容量大(38 kb)，不会随机插人细胞染色体内山1引起细胞突变4」。而且，杆状病毒制备简单，可在常规实验室内进行:M。等〔9〕通过重组GFP及 Lac-Z基因杆状病毒体外感染人和鼠的胰岛细胞，发现杆状病毒介导的目的基囚可以在胰岛细胞内成功表达，且具有较高的感染效率，即使MOI达到1 000 时一也未见细胞毒性。目前针对杆状病毒作为载体介导报告基因感染胰岛细胞的研究有限，且未见相关 Bac-NIS感染胰岛细胞的研究、 本实验分别通过重组杆状病毒介导GFP , N LS基因转染SD大鼠的胰岛细胞。实验研究结果显示，在较低的MOI(MOI=40)条件下，重组GFP基因杆状病毒感染胰岛细胞的百分比可达95%左右，表明重 组杆状病毒可高效介导的报告基因感染胰岛细胞; 且无细胞毒性，介导的报告基因表达时间较长，可达 2周左右。同时，重组NIS基因杆状病毒感染的胰岛细胞表现出摄碘的功能，以及NaC10、抑制其摄碘等特性，该特性与报道的NIS基因特性一致’。 NIS是一种位于甲状腺细胞膜上的糖蛋白，可借助细胞膜外Na+电势差，同向转运一个I一和两个 Na+至甲状腺细胞内，其能量主要来自Na+ -K -ATP 酶[11]，可被竞争性抑制剂高氯酸盐抑制。它不仅能够介导放射性碘离子的摄取，还可介导高碍酸盐等化合物的摄取。这些放射性药物均为临床常用放射性药物，无免疫原性，来源方便，均可通过临床常规和单光子发射计算机断层成像术(single-photon emission computed tomo- graphy , SPECT )进行显像，被认为是一种可用于显像的优良报告基因[12].

本研究发现胰岛细胞感染Bac-NIS 60 min时的 CPM达到高峰，之后逐渐降低，未见平台期，表明 Bac-NIS感染的胰岛细胞表达的NIS像甲状腺细胞膜上的NIS一样，具有摄碘功能，但不能有效进行碘的有机化及储存。故胰岛细胞摄取的放射性碘不能有效滞留而很快被排出，细胞接受的辐射剂量小，避免了对细胞的辐射损伤[13]。 了解移植胰岛细胞体内存活状况是利用胰岛移植方法治疗1型糖尿病研究的重要内容之一。本研究结果显示，Bac-NIS可高效感染胰岛细胞摄取放射性碘，为活体条件下无创早期监测移植胰岛细胞不同时间的存活状态及免疫排斥反应等具有重要价值.

参考文献

[1]Strizhakov AN. Modern aspects of the etiology and pathogenesis of various forms of genital endometriosis[J].Akusherstvo i Ginekologiia(Mosk),1980,(10):13-17.

[2]Liu Y,Hu J,Shen W. Peritoneal fluid of patients with endometriosis promotes proliferation of endometrial stromal cells and induces COX-2 expression[J].Fertility and Sterility,2011,(05):1836-1838.

[3]Banu SK,Lee J,Speights VO Jr. Cyclooxygenase-2 regulates survival,migration,and invasion of human endometriotic cells through multiple mechanisms[J].Endocrinology,2008,(03):1180-1189.

[4]Reis FM,Di Blasio AM,Florio P. Evidence for local production of inhibin A and activin A in patients with ovarian endometriosis[J].Fertility and Sterility,2001,(02):367-373.

[5]Florio P,Rossi M,Sigurdardottir M. Paracrine regulation of endometrial function:interaction between progesterone and corticotropin-releasing factor (CRF) and activin A[J].Steroids,2003,(10-13):801-807.

[6]Myers M,Gay E,McNeilly AS. In vitro evidence suggests activin-A may promote tissue remodeling associated with human luteolysis[J].Endocrinology,2007,(08):3730-3739.

[7]Jabbour HN,Milne SA,Williams AR. Expression of COX-2 and PGE synthase and synthesis of PGE (2)in endometrial adenocarcinoma:a possible autocrine/paracrine regulation of neoplastic cell function viaEP2/EP4 receptors[J].British Journal of Cancer,2001,(07):1023-1031.

[8]Torres PB,Florio P,Galleri L. Activin A,activin receptor type Ⅱ,nodal,and cripto mRNA are expressed by eutopic and ectopic endometrium in women with ovarian endometriosis[J].Reprod Sci,2009,(08):727-733.

[9]Wang H,Gorpudolo N,Li Y. Elevated vascular endothelia growth factor-A in the serum and peritoneal fluid of patients with endometriosis[J].Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Science),2009,(05):637-641.

[10]Ferreira MC,Witz CA,Hammes LS. Activin A increases invasiveness of endometrial cells in an in vitro model of human peritoneum[J].Molecular Human Reproduction,2008,(05):301-307.