子宫内膜异位症和子宫腺肌病P450arom和COX2mRNA的表达及意义

作者:曲晓媛

 作者单位：青岛大学医学院附属医院妇科，山东 青岛 266003

   【摘要】  目的 研究细胞色素芳香化酶P450（P450arom）基因和环氧化酶2（COX2）基因在子宫内膜异位症（EMs）和子宫腺肌病（AM）在位和异位内膜中的表达及相关性。方法 应用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）技术，检测22例正常子宫内膜、42例EMs及33例AM的在位和异位内膜中P450arom mRNA和COX2 mRNA的表达，并进行相关性分析。结果 P450arom mRNA在正常子宫内膜无表达，在EMs和AM的在位和异位内膜中均有表达，与正常子宫内膜比较差异均有显著性（F=28.777，q=4.624～10.282，P＜0.01)。P450arom mRNA在EMs和AM异位内膜中的表达均高于在位内膜，差异有显著性（q＝2.964、2.655，P＜0.01、0.05)。COX2 mRNA在正常子宫内膜无表达或弱表达，在EMs和AM的在位和异位内膜中均有表达，与正常子宫内膜比较差异均有显著性（F=21.307，q=2.583～7.905，P＜0.01)；在正常子宫内膜、EMs在位和异位子宫内膜中分泌期表达高于增殖期，差异均有显著性（t=4.401～15.865,P＜0.05)；在AM表达不随月经周期变化。COX2 mRNA在EMs和AM异位内膜中的表达均高于在位内膜，差异均有显著性（q=2.623、5.908，P＜0.05）。P450arom mRNA和COX2 mRNA在EMs的表达与rAFS分期均无相关性。P450arom mRNA与COX2 mRNA在EMs中的表达水平呈正相关（r=0.964，P＜0.01）；在AM中的表达水平亦呈正相关（r=0.813，P＜0.01）。结论 P450arom和COX2与EMs和AM的发病相关，二者协同作用促进EMs和AM的发生发展。

【关键词】  芳香酶 环氧化酶2 子宫内膜异位症 子宫腺肌病

    EXPRESSIONS OF AROMATASE CYTOCHROME P450 mRNA AND CYCLOOXYGENASE2 mRNA IN ENDOMETRIOSIS AND ADENOMYOSISQU XIAOYUAN, WANG YANKUI, XU BING,  et al (Department of Obstetrics and Gynecology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China) ［ABSTRACT］ObjectiveTo study the mRNA expressions of aromatase cytochrome P450 and cyclooxygenase2 (COX2) in endometriosis (EMs) and adenomyosis (AM) and their correlation with the diseases. MethodsThe expression of P450arom mRNA and COX2 mRNA were assessed by RTPCR in 22 cases of normal endometrium, 42 of EMs and 33 of AM including the eutopic and ectopic endometrium. The correlation between the mRNA expressions were analyzed. ResultsP450arom mRNA was expressed both in eutopic and ectopic endometrium of EMs and AM. But in normal endometrium, P450arom mRNA expression was not found. The difference between them was significant (F=28.777, q=4.624-10.282，P＜0.01). The P450arom mRNA expressions in ectopic endometrium of EMs and AM were significantly higher than that in eutopic endometrium (q＝2.964,2.655；P＜0.01, 0.05). COX2 mRNA was not or weakly expressed in normal endometrium, but it, in ectopic and eutopic endometrium of EMS and AM, significantly upregulated compared with normal endometrium (F=21.307，q=2.583-7.905，P＜0.01). Furthermore, the expression of COX2 mRNA in secretory phase was significantly higher than in proliferative phase in normal endometrium and EMs (t=4.401-15.865,P＜0.05). No significant changes of COX2 mRNA expression were found throughout the menstrual cycle in AM. The COX2 mRNA expressions in ectopic endometrium of EMs and AM were significantly higher than that in eutopic endometrium （q=2.623,5.908;P＜0.05）. There were no correlation between the mRNA expressions of 450arom and COX2 in EMs，and rAFS phases. There was a positive correlation between P450arom mRNA expression and COX2 mRNA expression in EMs （r=0.964，P＜0.01) and AM （r=0.813，P＜0.01）.ConclusionP450arom and COX2 mRNA expressions are closely correlated with the pathogenesis of EMs and AM. The synergistic action of the two enhances the occurence and development of EMs and AM.

［KEY WORDS］aromatase; cyclooxygenase2; endometriosis; adenomyosis

    子宫内膜异位症（EMs）和子宫腺肌病（AM）是育龄妇女的常见病、多发病，其发病率有明显上升趋势，但确切的发病机制尚未完全明了。目前已公认是一种雌激素依赖性疾病，细胞色素芳香化酶P450（P450arom）是雌激素合成的限速酶［1］,而前列腺素E2(PGE2)则是P450arom的强诱导剂，环氧化酶2（COX2）又是前列腺素(PG)合成的限速酶。本研究应用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）技术，检测P450arom mRNA和COX2 mRNA在EMs和AM在位和异位内膜中的表达，研究P450arom和COX2之间的关系，探讨P450arom和COX2与EMs和AM发病的关系。

    1  资料和方法

    1．1  一般资料

    2005年3月～2005年12月，选择在青岛大学医学院附属医院经开腹手术或腹腔镜手术病理证实为卵巢巧克力囊肿EMs病人42例，年龄25～50岁，平均（34.10±6.93）岁。取其异位囊肿组织，同时刮取在位子宫内膜，其中增殖期18例，分泌期24例。同期选择经开腹手术病理证实为AM的病人33例，年龄28～51岁，平均年龄（44.44±5.29）岁；分别取其子宫肌层异位病灶和在位内膜，其中增殖期14例，分泌期19例。另选择同期在我院因宫颈原位癌或宫颈癌（Ⅰ期）手术并经病理证实为正常子宫内膜标本22例作为对照，病人年龄32～49岁，平均年龄（39.67±6.92）岁；其中增殖期14例，分泌期8例。所有病人术前3个月均未接受任何激素治疗。两组年龄比较差异无显著性（P＞0.05）。EMs组采用修订的美国生育协会评分法(rAFS)进行分期，其中Ⅰ～Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期27例。

    1．2  主要试剂

    RNA提取液Trizol购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒、Taq酶为美国Promega公司产品。

    1．3  方法

    1．3．1  标本处理  术后立即取出标本,迅速置于液氮中，后于-70 ℃保存。

    1．3．2  RTPCR技术检测  ①总RNA的提取：按Trizol试剂说明书进行。琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA的完整性，紫外线分光光度计测定吸光度值以确定RNA含量和纯度。②cDNA合成：取1 μg总RNA，0.5 μg Oligo(dT),15 U AMV逆转录酶，于20 μL反应体系中42 ℃水浴1 h,合成cDNA。③PCR反应:P450arom、COX2及GAPDH引物由上海生物工程有限公司合成。P450arom上游引物：5′TGTATGGACTTTGCCACTGAG3′(947～967 bp)，下游引物为：5′ATGACCAAGTCCACGACAG 3′(1 227～1 245 bp),扩增产物长299 bp。COX2上游引物：5′TTCAAATGAGATTGTGGGAAAAT 3′(574～596 bp)，下游引物：5′AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTT 3′(855878 bp),扩增产物长为305 bp。GAPDH上游引物：5′AAGGTCGGAGTCAACGGATT 3′,下游引物为：5′CATGAGTCCTTCCACGATAC 3′，扩增产物长513 bp。以cDNA为模板,在25 μL反应体系内分别扩增P450arom、COX2和GAPDH。P450arom循环条件：94 ℃预变性5 min；然后95 ℃、1 min,58 ℃、30 s,72 ℃ 、30 s,35个循环；最后72 ℃延伸5 min。COX2循环条件为：94 ℃预变性5 min；然后95 ℃、1 min,52 ℃、30 s,72 ℃、30 s,35个循环；最后72 ℃延伸5 min。GAPDH循环条件：94 ℃预变性5 min，然后95 ℃、1 min,57 ℃、45 s,72 ℃、45 s,30个循环；最后72 ℃延伸5 min。取5 μL PCR产物于20 g/L琼脂糖凝胶电泳(80 V,60 min),分别用凝胶成像仪分析RTPCR产物带的积分吸光度值(A)。分别用P450arom/GAPDH、COX2/GAPDH扩增量表示组织标本的相对表达水平。

    1．3．3  统计学方法  本文结果采用SPSS 11.5统计软件包进行方差分析和t检验。相关性比较采用Spearman相关分析。

2  结    果

    2．1  P450arom mRNA在正常、EMs和AM子宫内膜中的表达

    P450arom mRNA在正常子宫内膜无表达，在EMs和AM的在位和异位内膜中均有表达，与正常子宫内膜比较差异均有显著意义（F=28.777，q=4.624～10.282，P＜0.01)；P450arom mRNA在EMs和AM异位内膜中的表达均高于在位内膜，差异均有显著性（q=2.964、2.655，P＜0.01、0.05)。见表1。

    2．2  COX2 mRNA在正常、EMs和AM子宫内膜中的表达

    COX2 mRNA在正常子宫内膜无表达或弱表达，在EMs和AM的在位和异位内膜中均有表达，与正常子宫内膜比较差异均有显著性（F=21.307,q=2.583～7.905，P＜0.01)；COX2 mRNA在EMs和AM异位内膜组织的表达均高于在位内膜，差异均有显著意义（q=2.623、5.908，P＜0.05）。见表1。

    2．3  P450arom mRNA与COX2 mRNA表达与月经周期的关系

    在EMs和AM在位和异位子宫内膜中，增殖期和分泌期表达差异均无显著意义（t=0.0171～1.697,P＞0.05）。在正常子宫内膜、EMs在位和异位子宫内膜中分泌期表达高于增殖期，差异均有显著性（t=4.401～15.865,P＜0.05)；在AM表达不随月经周期变化。见表2、3。表1  P450arom及COX2 mRNA在正常、EMs、AM子宫内膜中的表达表2  P450arom mRNA表达与月经周期的关系表3  COX2 mRNA表达与月经周期的关系

    2.4  不同期别EMs异位内膜P450arom mRNA与COX2 mRNA的表达

    P450arom mRNA在rAFSⅠ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期的相对表达水平分别为0.272±0.063、0.282±0.057，两者比较差异无统计学意义（t=0.489,P＞0.05）。COX2 mRNA在rAFSⅠ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期的相对表达水平分别为0.304±0.075、0.323±0.067，两者比较差异无统计学意义（t=0.850，P＞0.05）。

    2．5  P450arom mRNA与COX2 mRNA在EMs和AM中表达的相关性

    P450arom mRNA与COX2 mRNA在EMs中的表达水平呈正相关（r=0.964，P＜0.01）；在AM中的表达水平亦呈正相关（r=0.813，P＜0.05）。

    3  讨    论

    3.1  P450arom mRNA在正常、EMs和AM子宫内膜中的表达

    本研究结果显示，P450arom mRNA在正常子宫内膜组织不表达，在AM和EMs在位及异位内膜中均有表达，异位内膜中P450arom mRNA的表达比在位内膜中高，且增殖期与分泌期表达无差异，与国外研究结果一致［2］。提示在正常的子宫内膜组织P450arom无活性或它在正常月经周期的雌激素合成过程中所起的作用较弱；P450arom在EMs和AM阳性表达，且异位内膜中P450arom mRNA的表达比在位内膜中高，表明了在EMs和AM的发生过程中，P450arom的升高可导致局部雌激素合成增加，且异位病灶腺体对P450arom mRNA和雌激素的敏感性比在位内膜高，从而促进异位子宫内膜在卵巢组织和子宫肌层的生长，最终引起EMs和AM。

    3.2  COX2 mRNA在正常、EMs和AM子宫内膜中的表达

    OTA等［3］应用免疫组化方法研究显示，正常子宫内膜COX2表达水平以增生早期最低，此后逐渐增加，在整个分泌期都维持在高水平。本研究显示，正常子宫内膜增殖期腺上皮表达极低水平的COX2，分泌期较增生期明显升高。另外，COX2 mRNA在EMs和AM的在位和异位内膜中均有表达，异位内膜组织COX2 mRNA的表达高于在位内膜；COX2 mRNA在正常子宫内膜、EMs在位和异位子宫内膜的表达水平随月经周期发生显著变化，分泌期高于增生期，在AM不随月经周期变化，这与OTA等［3］报道的结果相一致。AM异位子宫内膜COX2 mRNA表达水平不随月经周期变化，可能由于AM异位子宫内膜属于基底层内膜，对卵巢激素特别是孕激素不敏感。EMs及AM在位内膜COX2 mRNA过表达的机制尚不清楚。己有报道，EMs及AM在位子宫内膜自身免疫反应增强［3］。

本研究结果显示，P450arom mRNA和COX2 mRNA在EMs的表达与rAFS分期无相关性。rAFS分期是根据疾病的程度和囊肿的大小进行评分,病灶的活性及病理特点并不包括在内。rAFS评分不能代表病灶活性的高低,P450arom mRNA和COX2 mRNA的表达能代表异位病灶的活性,与EMs的严重程度无相关关系。与FAGOTTI等［4］的研究结果相一致。

    3.3  P450arom mRNA与COX2 mRNA在EMs和AM中表达的相关性及意义

    EMs和AM两种疾病同属雌激素依赖性疾病，P450arom是CYP19基因的产物，是雌激素合成的关键酶，在EMs和AM的发生发展中起着重要作用。COX2在此过程中亦扮演着重要角色。目前P450arom与COX2抑制剂用于乳癌的防治已进入了临床试验阶段［5,6］,而在EMs和AM方面的研究却相对滞后。在乳癌CYP19基因表达与COX1、COX2基因表达的初级研究中，运用双变量进行的回归分析表明，COX1、COX2的总表达与CYP19基因的表达间存在直线相关关系。此外，运用免疫组化方法进行的P450arom与COX2的研究表明，在肿瘤组织中P450arom与COX2的表达显著相关。目前尚未见EMs和AM与P450arom和COX2相关关系的报道。本研究显示，P450arom mRNA与COX2 mRNA的表达水平在EMs和AM中均呈正相关，表明P450arom与COX2协同作用导致EMs和AM局部雌激素合成增加,从而促进EMs和AM的发生发展。基于本研究结果，可用下面的模型阐述P450arom与COX2的相互关系：高表达水平的COX2及COX2活性的增加导致了PGE2的高表达，而PGE2通过增加细胞内cAMP水平增强P450arom的表达，P450arom的高表达导致雌激素水平升高，通过这种自分泌和旁分泌的机制，使异位内膜在雌激素刺激下逐渐生长壮大,促进异位病灶的种植生长，从而引起EMs和AM。本研究结果显示P450arom与COX2之间存在相关性，在此基础上，可以设想通过使用COX2抑制剂抑制COX2 mRNA的表达，从而抑制P450arom mRNA的表达，或者将P450arom抑制剂与COX2抑制剂联合应用，使雌激素水平降低，达到治疗EMs和AM的目的。

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