Livin在乳腺癌中的表达及其与Caspase3，Ki67表达的关系

作者:陈建华,范钦和,丛玲华,

作者单位：1.南京医科大学第一附属医院病理科，江苏 南京 210029; 2.江苏大学附属人民医院病理科，江苏　镇江 212002

    【摘要】  　　目的： 探讨Livin在乳腺癌中的表达和临床意义及其与Caspase3蛋白表达和细胞增殖的相互关系。方法： 采用免疫组化SP法检测Livin在正常乳腺组织、乳腺增生性病变、乳腺非浸润性癌和乳腺浸润性癌组织中Livin蛋白和Caspase3蛋白表达以及Ki67在乳腺癌组织中的表达。结果： Livin蛋白在正常乳腺组织、乳腺增生性病变、乳腺非浸润性癌和乳腺浸润性癌组织中阳性率为7.1%，29.8%，65.0%，73.1%；Caspase3蛋白分别为92.9%，71.4%，45.0%，34.6%，两者差异均有统计学意义(P<0.01)。Livin表达与临床分期、淋巴结转移和年龄有关(P<0.05)，与肿瘤大小和组织学分级无关。Livin蛋白与Caspase3蛋白在乳腺浸润性癌表达呈负相关(P<0.01)。在乳腺非浸润性癌中两者相当，无相关性(P>0.05)。Livin蛋白表达阳性的乳腺癌Ki67的标记细胞增殖指数(47.32±22.34)明显高于Livin蛋白表达阴性的乳腺癌细胞Ki67的标记细胞增殖指数(18.01±23.34)( P<0.01)。结论： Livin蛋白在乳腺癌中表达上调，可作为判断乳腺癌预后新的分子标记物，成为乳腺癌诱导凋亡治疗的新靶点。Livin不仅参与细胞凋亡的调控，还促进了细胞增殖及肿瘤发生、发展。

【关键词】  乳腺癌 Livin 免疫组织化学 凋亡 增殖

　　Expresstion of Livin in breast carcinoma and its relationship　with Caspase3 and Ki67

　　CHEN Jianhua， FAN Qinhe， CONG Linghua， SHI Yang， YAO Chenghu

　　1. Department of  Pathology，the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University ，Nanjing  Jiangsu　212002;

　　2. Department of Pathology，the Affiliated People's Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 210029,China

　　［Abstract］  Objective: To investigate expression of  Livin and its relationship with Caspase3  and proliferation in breast carcinoma. Methods： To detect Livin protein and Caspase3 protein expression and Ki67 expression in the normal breast tissues，proliferative breast disease(epithelial hyperplasia)，breast preinvasive carcinoma and breast invasive carcinoma by immuohistochemisitry (SP method).  Results： The positive rates of Livin protein expression were 7.1%，29.8%，65.0%，73.1% in the normal breast tissues，proliferative breast disease，breast preinvasive carcinoma and breast invasive carcinoma and the positive rate of  Caspase3 protein were 93%，71%，45%，34% respectively .The expression of Livin and Caspase3 in four  groups had ststistical difference(P<0.01). Livin expression was related to clinic stage，lymphnode metastasis and age(P<0.05)，but not to tumor size or histological grade (P>0.05).The expression of Caspase3 was negatively correlated with the expression of Livin(P<0.01)，but not in breast preinvasive carcinoma. The Ki67 indexes were significantly higher in Livin positive tumors(47.32±22.34) than those in the negative ones(18.01±23.34)( P<0.01).  Conclusion： High incidence of positive expression of Livin indicates it may be served as a molecular marker of breast carcinoma and a new target for apoptosisinducing therapy of breast carcinoma . Livin was not only involved in control apoptosis，but also accelerated proliferation.

［Key words］  breast carcinoma； Livin gene； immuohistochemisitry； apoptosis； proliferation

    近年来，乳腺癌发病率及检出率正逐年上升，已居女性恶性肿瘤之前列。目前研究表明肿瘤的发生、发展与细胞凋亡基因及抑制细胞凋亡基因相互调控作用密切相关。Livin基因是2000年3个试验小组差不多同时发现的抑制细胞凋亡基因［1-3］，其作用途径主要通过与Caspase家族相互作用［3］，而执行型Caspase3与 凋亡关系最密切，参与多种因素诱导的细胞凋亡。本研究应用免疫组织化学技术检测乳腺癌中Livin蛋白的表达情况并探讨其与Caspase3的表达以及细胞增殖的关系。

　　1  材料与方法

　　1.1  资料来源　

    乳腺肿瘤组和对照组标本均取自江苏大学附属人民医院病理科2006年1月～2007年1月手术标本，标本离体后立即切块固定，石蜡切片，乳腺癌全部病例行根治手术，术前均未接受过放疗或化疗。所有病例均为女性，年龄29～80岁，平均年龄为(52.68±12.61)岁。肿瘤大小(2.44±0.99)cm。非浸润性导管癌20例，包括囊内乳头状癌3例。浸润性癌中非特殊类型47例，小叶癌4例，黏液癌1例。所有病例均经HE切片证实，非特殊类型47例按WHO所采用的ScarffBloomRichardson(SBR)标准［5］进行组织学分级，Ⅰ级14例，Ⅱ级16例，Ⅲ级17例。按国际抗癌联盟的TNM分期法分期，Ⅰ期28例，Ⅱ期30例，Ⅲ期7例，Ⅳ期7例。

　　1.2  免疫组化及判断标准

　　1.2.1  方法
 
　　采用免疫组化SP法，Livin（1∶50）兔抗人多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，可检测Livinα和Livinβ。Caspase3（1∶100）单克隆抗体购自美国Labvision公司,Ki67和SP试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。常规石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇至水，抗原修复后，3%Ｈ2Ｏ2阻断内源性过氧化物酶，一抗4℃冰箱过夜，依次加入二抗、三抗室温下孵育各10 min，各步骤间以PBS漂洗，PBS中含有1%Tween20液，最后DAB显色。苏木精复染、脱水、透明、封固。以PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1.2.2  判断标准
 
　　Livin和Caspase3阳性产物定位于细胞质内，细胞质呈棕黄色或出现棕褐色颗粒为阳性。采用半定量积分法先按染色强度评分： 凡显色强度与背景无明显差别者为阴性，记为0分，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。再按阳性细胞所占百分比评分：0分为阴性，1分为阳性细胞≤10%，2分为11%～50%，3分为51%～75%，4分为>75%，染色强度与阳性细胞数乘积≥2分为阳性（图1，2，4）。Ki67阳性产物定位于细胞核，细胞核内出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。

　　1.3  增殖指数
　
    采用HMIAS2000高清晰度彩色图文分析系统，每张切片选择10个高倍视野，每个视野计数100个细胞，共计数1000个肿瘤细胞。计数Ki67染色阳性细胞所占的百分比，即为增殖指数。

　　1.4  统计学处理　

    用SPSS11.0统计软件，选择χ2检验和精确概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结  果

　　2.1  Livin蛋白和Caspase3蛋白表达及其相互关系

    Livin蛋白在正常乳腺组织、乳腺增生性病变、乳腺非浸润性癌和乳腺浸润性癌四组病例中表达分别为7.1%，29.8%，65.0%，73.1%；Caspase3蛋白分别为92.9%，71.4%，45.0%，34.6%，两者差异均有统计学意义(P<0.01)。Livin蛋白在病变进展过程中呈递增趋势，而Caspase3蛋白呈递减趋势。

    Livin蛋白和Caspase3蛋白进行相关分析发现Livin蛋白与Caspase3蛋白在乳腺浸润性癌表达呈负相关(P<0.01)，见表1。在乳腺非浸润性癌中两者相当，相关性不显著(P>0.05)，见表2。但总的来说，在乳腺癌中两者表达呈负相关(P<0.01) ，见表3。表1  乳腺浸润性癌中Livin蛋白表达与Caspase3表达的关系（略）表2  乳腺非浸润性癌中Livin蛋白表达与Caspase3表达的关系（略）表3  乳腺癌中Livin蛋白表达与Caspase3表达的关系（略）
2.2  Livin蛋白在乳腺癌中的表达与临床病理参数的关系

    Livin蛋白的表达与临床分期、淋巴结转移和年龄有关(P<0.05)，临床分期越高，表达越强，年龄小者表达较强，淋巴结转移者表达率高；与肿瘤大小、组织学分级均无关,见表4。表4  Livin蛋白在乳腺浸润性癌中的表达与临床病理参数的关系（略）
   
　　2.3  乳腺癌中Livin表达与癌细胞增殖指数的关系　

    51例Livin表达阳性的乳腺癌组织中Ki67标记的增殖指数为(47.32±22.04)，21例Livin阴性表达的乳腺癌组织中Ki67的标记增殖指数为(18.01±23.34)，两者之间比较差异有统计学意义(P<0.01)。

　　3  讨  论
      　
　　Livin基因是一种新发现的IAP成员［1］，基因位于人染色体20 q13.3，全长4.6 kb，包含7个外显子及6个内含子，其基因转录产物有两种mRNA亚型，分别编码298个氨基酸蛋白质(α)和280个氨基酸蛋白质(β)，Livin蛋白N端仅包含一个BIR结构，C端含一个RING环指结构。目前报道Livin基因只在黑色素瘤、结肠癌、前列腺腺癌和膀胱癌等少数肿瘤细胞中及在胎盘、胚胎组织中表达，在多数正常成人组织中不表达。这一表达的特异性使得Livin基因成为目前国际研究的热点［5］。

    Livinα、β及蛋白主要表达于细胞质［1-3］，但Kasof等［3］认为Livin细胞分布与Survivin相似，即可在胞质和胞核内呈纤维丝状表达，而Ka和Hunt［6］对胎盘、滋养层细胞和绒毛膜癌细胞系染色，阳性显色仅定位于胞核。本实验中所有阳性显色均位于肿瘤细胞的胞质中，这与Vucic等［7］对乳腺癌研究发现Livin在细胞中主要表达于胞质而不是纺锤体上的结果是一致的。

    Livin抑制细胞凋亡作用主要通过其BIR区(位于Livin的86至154氨基酸处)与半胱氨酸蛋白水解酶（Caspases家族）结合，抑制其活性，与Caspases蛋白家族中的多个成员相互作用，尤其是Caspases3/7和Caspases9的活性，阻止Caspase蛋白在细胞凋亡时执行蛋白切除功能，达到阻断凋亡受体及以线粒体为基础的凋亡途径而起作用. Caspase3是Caspase家族中最重要的凋亡执行者之一，全部或部分负责大量底物的蛋白水解，抑制Caspase3的活性或拮抗其功能可使细胞凋亡受抑，说明Caspase3对细胞凋亡是必需的。本实验结果表明Livin蛋白在正常乳腺组织、乳腺增生性病变、乳腺非浸润性癌和乳腺浸润性癌四组病例中表达呈递增趋势，而Caspase3蛋白呈递减趋势。这说明Livin和Caspase3在乳腺癌发生、发展中的起着重要作用。Livin与Caspase3的乳腺癌中表达呈负相关(Ｐ<0.01)，这证实Livin可通过对诱发凋亡的效应性蛋白酶Caspase3有直接抑制作用［3］。在细胞中Livin蛋白将Caspase3牢牢地连接在中心粒上，而使Caspase3无法发挥蛋白水解的催化功能。凋亡途径因此失去重要的酶，而无法进行凋亡酶依赖的凋亡。此外，在非浸润乳腺性癌中两者相当，无相关性(P>0.05)。这可能在乳腺性癌进展中Livin有着重要的作用。

    本研究发现Livin表达与临床分期、淋巴结转移和年龄有关，可成为判断乳腺癌预后不良新的标记物，年龄小者作用更强。这可能说明年轻患者乳腺癌发生过程中与Livin关系更为密切，还有待进一步探讨。

    Ki67被认为是一个判断细胞凋亡和增殖的有价值的标记物，和肿瘤的性质、复发、转移和预后有密切的关系。含有BIR功能区的IAP蛋白通过抑制有丝分裂中期进入有丝分裂后期［8］。实验研究发现Livin蛋白的表达与乳腺癌细胞Ki67的表达呈明显正相关，Livin蛋白表达阳性的乳腺癌Ki67的标记指数明显高于Livin蛋白表达阴性的乳腺癌细胞的Ki67标记指数(P<0.01)。说明Livin不仅参与凋亡的调控，还促进了细胞增殖。

已有文献报道，Livin在人乳腺癌细胞系MCF7，MDAMB435中有少量表达。乳腺癌血清中抗Livin抗体表达率（32.6％）象Survivin一样，Livin可能是乳腺癌患者的主要肿瘤抗原［9］。Livin mRNA为靶点的反义核酸作用与MCF7乳癌细胞，能够有效地抑制Livin基因的表达，增加Caspase3的活性，诱导MCF7细胞凋亡，明显抑制其生长，Livin可能会成为抗肿瘤治疗新的基因靶点［10］。

    总之，Livin在乳腺癌中表达上调，提示在乳腺癌发生、发展中起重要作用，可作为判断乳腺癌预后新的分子标记物，为乳腺癌基因治疗提供新靶点。Livin不仅参与细胞凋亡的调控，还促进了细胞增殖及肿瘤发生、发展。
   
　　(本文图1～图4见插图)

【参考文献】
  　　［1］Lin JH，Deng G，Huang Q，et al. KIAP，a navel member of the inhibitor of apoptosis protein family［J］. Biochem Biophys Res Commun，2000，279(3)：820-831.

　　［2］Vucic D，Stennicke HR，Pisabarro MT，et al. MLIAP，a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas［J］.Curr Biol，2000，10(21)：1359-1366.

　　［3］Kasof GM，Gomes BC. Livin，a novel inhibitor of apoptosis protein family member［J］. J Biol Chem，2001，276(5)：3238-3246.

　　［4］Bloom H，Richardson W. Histological grading and prognosis in breast cancer［J］.Br J cancer，1957，9(11)：359-377.

　　［5］Gzzaniga P，Gradilone A，Giuliani L，et al.Expression and prognostic significance of Livin，Survivin and other apoptosis related genes in the progression of superficial bladder cancer［J］.Ann Oncol，2003，14(1)：85-90.

　　［6］Ka H，Hunt JS. Temporal and spatial patterns of expression of inhibitors of apoptosis in human placentas［J］. Am J Pathol，2003，163(2)：413-422.

　　［7］Vucic D，Deshayes K，Ackerly H，et al. SMAC negatively regulates the anti2apoptotic activity of melanoma inhibitor of apoptosis (MLIAP)［J］. J Biol Chem，2002，277(14)：12275-12279.

　　［8］Fraser AG，James C，Evan GI，et al. Caenorhabditis elegans inhibitor of apoptosis protein (IAP) homologue BIR1 plays a conserved role in cytokinesis［J］.Curr Biol，1999，9(6)：292-301.

　　［9］Yagihashi A，Ohmura T，Asanuma K，et al. Detection of autoantibodies to survivin and livin in sera from patients with breast cancer［J］. Clin Chim Acta，2005，362(1-2)：125-130.

　　［10］Zhang HD，Yuan SJ，Chen HP，et al.Indution effects of antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotides of Livin mRNA on apoptosis in MCF7 cells［J］.Chin J Clin Pharm Ther，2004，9(12)：1353-1356.