子宫内膜癌组织uPA 和PAI1 mRNA表达及其意义

作者：孟丽 山峰 刘相萍 王蓁    作者单位：青岛大学医学院附属医院, 山东 青岛 266003 妇科； ICU； 分子生物学研究室
【摘要】  　　目的 探讨纤溶酶原激活因子（uPA）及纤溶酶原抑制因子1（PAI1） mRNA在子宫内膜癌组织表达及意义。方法 采用半定量逆转录聚合酶链反应（RTPCR）技术，检测35例子宫内膜癌、18例子宫内膜增生和16例正常子宫内膜组织中uPA及PAI1 mRNA的表达情况。结果 uPA 、PAI1 mRNA在子宫内膜癌组织中表达水平均显著高于子宫内膜增生组织及正常子宫内膜组织（F=55.22、51.78,q=11.696～12.218,P<0.01）；而子宫内膜增生组织中uPA 、PAI1 mRNA的表达与正常子宫内膜组织比较，差异无统计学意义（q=0.215、0.441，P>0.05）。子宫内膜癌组织中uPA、PAI1 mRNA的表达水平随手术病理分期(F=17.28、21.88,q=9.347～84.716,P<0.01)及组织学分级的增高（F=31.22、27.95,q=6.960～10.931,P<0. 01）、肌层浸润深度的增加(t=2.885、3.316,P<0.01）及淋巴结的转移显著增高（t=5.177、3.954,P<0.01），与病人病理类型无关（t=0.060、0.115,P>0.05）。结论 子宫内膜癌组织uPA及PAI1 mRNA的高表达与子宫内膜癌发生、发展及浸润转移有一定关系，并且与疾病进展、预后有关。
【关键词】  子宫内膜肿瘤 尿纤溶酶原激活物 纤溶酶原激活物抑制物1 逆转录聚合酶链反应
　　EXPRESSIONS AND THEIR SIGNIFICANCE OF UROKINASETYPE PLASMINOGEN ACTIVATOR AND PLASMINOGEN ACTIVATOR INHIBITOR1 mRNA IN ENDOMETRIAL CARCINOMA
　　MENG LI, SHAN FENG, LIU XIANGPING, et al
　　(Department of Gynecology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China);
　　［ABSTRACT］ Objective To study the expressions of urokinasetype plasminogen activator (uPA) and plasminogen activator inhibitor1 (PAI1) mRNA in endometrial carcinoma. Methods The expressions of uPA and PAI1 gene in 35 cases of endometrial carcinoma and 18 of endometrial hyperplasia and 16 of normal endometrial tissues were detected by semiquantitative RTPCR.Results The expressions of uPA mRNA and PAI1 mRNA in the carcinoma tissue were significantly higher than in the hyperplasia and the normal tissue (F=55.22,51.78;q=11.696-12.218;P<0.01). The expressions of uPA and PAI1 gene in the hyperplasia were not significantly higher than those in normal group (q=0.215,0.441;P>0.05). They increased with the increase of pathological staging and histological grading (F=17.28,21.88;q=9.347-84.716;P<0. 01), with deeper myometrial invasion of the carcinoma (t=2.885,3.316;P<0.01), and with lymph node metastasis (t=5.177,3.954;P<0.01), which were not associated with pathologic typing (t=0.060,0.115;P>0.05). Conclusion The higher expressions of uPA and PAI mRNA are related to occurrence, development, metastasis, and prognosis of endometrial carcinoma.
   
　　［KEY WORDS］ Endometrial neoplasms; Urinary plasminogen activator; Plasminogen activator inhibitor 1; Reverse transcriptase polymerase chain eaction
   
　　子宫内膜癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤， 近年来其发病率呈上升趋势，影响其预后和疗效的主要因素是癌的浸润转移。尿激酶型纤溶酶原激活系统在肿瘤的侵袭与转移中起着重要的调节作用，此系统是体内生理或病理条件下通过降解细胞外基质、介导细胞转移的主要酶系[1]。它们作为主要的蛋白降解酶与恶性肿瘤细胞的迁移、侵袭、转移及预后密切相关。本研究旨在探讨纤溶酶原激活因子（uPA）及纤溶酶原抑制因子1（PAI1）mRNA在子宫内膜癌组织表达及其与子宫内膜癌发生、发展及浸润转移的关系。

1  资料与方法

　　1.1  对象
   
　　2005年9月～2006年11月，我院妇科住院及门诊病人68例，其中子宫内膜癌病人35例，子宫内膜增生病人18例（单纯性增生、复杂性增生及不典型增生各6例），对照组16例来自于子宫肌瘤和子宫脱垂的正常子宫内膜病人（分泌期8例，增生期8例）。子宫内膜癌病人年龄为41～73岁，平均56.6岁；对照组年龄为43～68岁，平均55.3岁。根据国际妇产科联盟(FIGO，2000)手术病理分期标准：Ⅰ期16例(Ⅰa期5例, Ⅰb期6例, Ⅰc期5例),Ⅱ期10例(Ⅱa期4例, Ⅱb期6例)，Ⅲ期8例（Ⅲa期5例，Ⅲc期3例）， Ⅳ期1例；病理类型：子宫内膜样腺癌27例，腺鳞癌6例，透明细胞癌1例，浆液性乳头状腺癌1例；组织学分级：高分化（G1）10例，中分化（G2）15例，低分化（G3）10例；肌层浸润：肌层浸润深度>1/2者15 例,≤1/2者13 例，无肌层浸润者7例；淋巴结转移：术后证实有淋巴结转移7例，无淋巴结转移28例。所有病人术前均未接受放、化疗，未服用过性激素类药物治疗。组织标本均分为两份：一份经液氮速冻后，立即置入-70 ℃冰箱用于提取组织RNA；另一份送病理检查以确定病理类型。

　　1.2  方法

　　1.2.1  总RNA抽提  每份冷冻标本取100 mg剪碎，加入1 mL TRIzol溶液裂解，按TRIzol试剂盒说明书一步法提取组织总RNA，紫外线分光光度计检测RNA浓度和纯度，放置-70 ℃冰箱保存。

　　1.2.2  RTPCR检测  引物的设计合成的序列如下。uPA引物序列，forward：5′ACTACTACGGCTCTGAAGTCACCA3′，reverse：5′GAAGTGTGAGACTCTCGTGTAGAC3′。RTPCR产物长度200 bp。PAI1引物序列，forward：5′TGCTGGTGAATGCCCTCTACT3′，reverse：5′CGGTCATTCCCAGGTTCTCTA3′。RTPCR产物长度398 bp。内对照看家基因GAPDH引物序列，forward：5′ACTGCCACCCAGAAGACT3′,reverse：5′ GCTCAGTGTAGCCCAGGAT3′。RTPCR产物长度为292 bp[2]。取1 μg总RNA,在50 μL体系中扩增，uPA RTPCR条件：50 ℃ 反转录30 min；然后95 ℃ 预变性15 min，94 ℃ 变性1 min，55  ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸1 min,28个循环；最后72 ℃ 延伸10 min。PAI1 RTPCR条件为：50 ℃ 反转录30 min；然后95 ℃ 预变性15 min，94 ℃ 变性1 min，60 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸1 min,32个循环；最后72 ℃ 延伸10 min。GAPDH RTPCR条件为：50 ℃ 反转录30 min；然后95 ℃ 预变性15 min，94 ℃ 变性1 min，60 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸1 min,28个循环；最后72 ℃ 延伸10 min。

　　1.2.3  RTPCR半定量分析  取3 μL PCR扩增产物，用20 g/L的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭显色，置于凝胶成像分析仪下经Bio Capt MW软件分析。将uPA、PAI1与GAPDH PCR产物电泳条带扫描灰度值比值作为uPA、PAI1基因表达的数值，并进行半定量分析mRNA的相对表达水平。

　　1.3  统计学处理
   
　　采用SPSS 11.0统计软件进行统计学分析,计量数据以±s表示。组间比较采用t检验、方差分析及q检验。

　　2  结果

　　2.1  不同子宫内膜组织中uPA mRNA和PAI1 mRNA的表达
   
　　子宫内膜癌组织中uPA及PAI1 mRNA的表达水平显著高于子宫内膜增生组织及对照组，差异均有极显著意义（F=55.22、51.78，q=11.696～12.218，P<0. 01）；子宫内膜增生组织uPA及PAI1 mRNA的表达水平与对照组比较，差异无统计学意义（q=0.215、0.441，P>0.05）。见表1、图1。

　　表1  uPA、PAI1 mRNA在不同子宫内膜组织中的表达（略）

　　图1  不同子宫内膜组织中uPA和PAI1 mRNA PCR产物电泳结果（略）
   
　　M:为Marker，①、⑤、⑨为对照组织，③、⑦、为子宫内膜增生组织，②、④、⑥、⑧、⑩、为子宫内膜癌组织

2.2  不同临床病理指标子宫内膜癌组织中uPA mRNA和PAI1 mRNA的表达
   
　　uPA、PAI1 mRNA在Ⅲ～Ⅳ期子宫内膜癌组织中表达水平明显明显高于Ⅰ期或Ⅱ期，差异有极显著性（F=17.28、21.88，q=9.347～84.716，P<0. 01）；Ⅱ期子宫内膜癌组织中uPA、PAI1 mRNA的表达水平高于Ⅰ期,差异有显著性（q=3.218、3.832，P<0.05）。在高、中、低不同分化程度的子宫内膜癌组织中uPA、PAI1 mRNA的表达随分化程度降低而增加，低分化子宫内膜癌组织中uPA、PAI1 mRNA的表达明显高于高分化或中分化组织，差异有极显著性（F=31.22、27.95，q=6.960～10.931，P<0.01）；中分化内膜癌组织中uPA、PAI1mRNA的表达明显高于高分化组织，差异有极显著性（q=4.041、4.512，P<0.01）。子宫内膜癌组织中uPA、PAI1 mRNA的表达与病理类型无关，在各病理类型中的表达差异无显著意义（t=0.060、0.115，P>0.05）。子宫内膜癌组织中uPA、PAI1 mRNA的表达随肌层浸润深度增加而增强，肌层浸润深度>1/2的癌组织中 uPA、PAI1 mRNA的表达明显高于≤1/2的癌组织及无肌层浸润的癌组织，两者比较，差异有极显著意义(t=2.885、3.316，P<0.01）。有淋巴结转移的癌组织中uPA、PAI1 mRNA的表达水平明显高于无淋巴结转移的癌组织，其差异有极显著意义（t=5.177、3.954，P<0.01）。见表2。

　　表2  子宫内膜癌组织中uPA、PAI1 mRNA的表达（略）

　　注：*包括腺鳞癌,透明细胞癌,浆液性乳头状腺癌；**包括肌层浸润≤1/2及无肌层浸润

　　3  讨论
   
　　1976年, ASTEDT 等[3]首先发现肿瘤细胞能产生uPA，其大部分与PAI1 形成复合物，小部分以单链无活性尿激酶原（prouPA）形式存在。prouPA经激活转化为纤溶酶。后者降解肿瘤细胞外基质,同时激活Ⅳ型胶原酶，使之降解基底膜的主要成分Ⅳ胶原，使基底膜产生灶性和直接的蛋白裂解，有利于肿瘤细胞的侵袭和转移。PAI1作为有效的特异性uPA抑制剂，维持胞外蛋白降解平衡，且阻止细胞外基质的过分降解，适当的细胞外基质及微血管基底膜局部降解可促进内皮细胞迁移、增殖，进而促进新生血管形成，促进肿瘤细胞的转移及种植并在转移灶形成新的肿瘤基质[4]。关于uPA系统在子宫内膜癌中表达的研究，国内外的研究很少且绝大多数集中在uPA系统组分在子宫内膜癌组织上的抗原表达。目前国内尚未见uPA和PAI1在子宫内膜癌基因表达方面研究的报道。本研究采用半定量RTPCR技术测定uPA mRNA和PAI1 mRNA在子宫内膜癌组织中的表达，以期在基因水平上发现两因子与子宫内膜癌发生、发展及浸润转移的关系，并分析其表达水平与子宫内膜癌临床病理指标的联系。
   
　　本研究结果显示， uPA、PAI1 mRNA在子宫内膜癌组织中的表达显著高于子宫内膜增生组织及正常子宫内膜组织，而子宫内膜增生组织与对照组织中uPA、PAI1 mRNA比较则无明显差异，说明uPA、PAI1基因过度表达在子宫内膜癌发生发展过程中有重要作用。TECIMER 等[5]运用ELISA法研究也显示，在子宫内膜癌中uPA 和PAI1的表达比正常内膜及增生内膜明显增强。本研究还显示，uPA、PAI1 mRNA在子宫内膜癌组织中的表达与其手术病理分期、组织学分级、肌层浸润深度及淋巴结的转移有关，手术病理分期越晚、组织学分级越高、肌层浸润越深及有淋巴结转移的子宫内膜癌组织中uPA、PAI1 mRNA的表达越高。而其表达与不同病理类型无关，差异无统计学意义。此结果表明子宫内膜癌组织中uPA、PAI1基因的表达水平上调与子宫内膜癌细胞的浸润转移及预后有关。因此,可以推断uPA、PAI1基因过度表达在子宫内膜癌的发生发展过程中具有重要作用，且与疾病的进展及预后密切相关。提示uPA 系统可以作为预测预后的指标，可能反映子宫内膜癌的转移和复发，对于病情估计、疾病分期、预后判断具有一定的价值。迄今人们已经研究发现uPA系统在卵巢癌、乳癌、胃癌、肺癌等肿瘤浸润转移中扮演重要角色[6～9],可望用来诊断肿瘤和评估预后。

人们不仅可以利用uPA、PAI1 mRNA表达水平变化判断子宫内膜癌病人预后、随诊治疗效果，也可以根据这些预后因素制订相应的治疗措施，而且可通过从基因水平抑制肿瘤相关蛋白酶的表达等进行基因治疗，例如应用反义RNA 技术下调uPA 和PAI1的表达，达到抑制肿瘤细胞浸润转移能力，控制和治疗肿瘤的目的。因此，随着纤溶酶原激活系统在肿瘤浸润和转移中作用的研究不断深入和临床治疗策略的不断完善，不仅为肿瘤的早期诊断、评估预后提供依据，还很有可能成为今后临床治疗肿瘤的一种新方法，为肿瘤治疗开辟一条新途径。

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　　[2]ANDREA L, PAOLA B, MARIA T S, et al. Urokinase plasminogen activator, uPA receptor and its inhibitor in vernal keratoconjunctivitis[J]. Invest Ophthalm Vis Sci, 2005,46:13641370.

　　[3]ASTEDT B, HOLMBERG L. Immunological identity of urokinase and ovarian carcinoma plasminogen activator released in tissue culture[J]. Nature, 1976,261(5561):595597.

　　[4]SCHMALFELDT B, PRECHTEL D, HARTING K, et al. Increased expression of matrix metalloproteinases (MMP)2, MMP9, and the urokinasetype plasminogen activator is associated with progression from benign to advanced ovarian cancer[J]. Clin Cancer Res, 2001,7(8):23962404.

　　[5]TECIMER C, DOERING D L, GOLDSMITH L J, et al. Clinical Relevance of urokinasetype plasminogen activator,its receptor, and its inhibitor type 1 in endometrial cancer[J]. Gynecol Oncol, 2001,80(1):4855.

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　　[9]PAPPOT H, PEDERSEN A N, BRUNNER N, et al. The complex between urokinase (uPA) and its type1 inhibitor (PAI1) in pulmonary adenocarcinoma: relation to prognosis[J]. Lung Cancer, 2006,51(2):193200.