浙江省宁波市水痘病例监测及流行株基因多态性分析

　　水痘是儿童期常见的病毒性传染病之一，传染性强，在出疹性疾病中水痘的传染性仅次于麻疹，多见于10岁以下的儿童。近几年，宁波市水痘疫情有明显上升趋势，为了解宁波市水痘一带状疤疹病毒(vzv)流行病学特征及流行株的基因分型特征，为水痘防控工作提供依据。本研究分析了宁波市2009-2011年水痘疫情及VZV基因型特征，结果报告如下。
　　材料与方法
　　一、资料及水痘样本采集
　　水痘病例监测资料来源于宁波市全国法定传染病报告系统2009-2011年收集的以个案为基础的疾病监测信息。人口数据资料来源于宁波市公安局人口统计年报。水痘事件报告资料来源于宁波市全国突发公共卫生事件报告管理信息系统2009-2011年收集的以事件为基础的监测信息。
　　水痘样本采集取临床诊断水痘患者的疤疹液，首先用无菌针头挑破水泡，用无菌棉签擦拭疤液及其基底部，最后将无菌棉签在盛有1mL0.9%氯化钠溶液的离心管中充分搅拌。混悬液冷藏条件下4h内运至实验室，在-70℃条件下保存。
　　二、核酸检测方法
　　采用罗氏公司的HighPureViralNucleicAcidKit试剂盒提取VZV核酸。根据Lopare、等的方法在VZV基因组的第22开放读码框(ORF22)中的第3765一4317位设计一对引物，上游5'-TGAGCGTTGGACACGTGATA-3'，下游5'-GCCTGTCTGATGT-3。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，获得长度为552by的目的基因片断后进行序列测定用于基因分型。在VZV的ORF62中特定区域合成另一对引物，上游5-TTCCCACCGCGGCACAAACA-3，下游5-GGTTGCTGGTGTTGGACGCG-3'。扩增出268by的片段进行酶切分析。上述引物合成和序列测定由英潍捷基(上海)贸易有限公司完成。PCR扩增及限制性内切酶Sma试剂采用TaKaRa(大连宝生物工程有限公司)试剂盒，按产品说明操作。
　　三、病毒分离
　　采用MRC-5细胞分离患者样本中的、将样本解冻混匀后800xg离心5min去除沉淀，上清加人浓度为1000U/mL的青霉素和1000p.剔L的链霉素、40C4h处理后，接种到长75%一90%单层的MRC-5细胞上同时设立细胞阴性对照，5%CO:培养箱37℃中培养。每天观察细胞病变，待出现特征性细胞病变后用PCR方法进行鉴定。
　　结果
　　一、水痘流行病学特征
　　2009-2011年底宁波市法定传染病系统分别报告水痘病例2182例、2688例和3648例，报告发病率分别为23.33/10万、26.24/10万和36.25/10万，发病率呈逐年增高趋势。水痘发病均呈现冬末春初和秋末冬初高发的季节性流行趋势，病例主要集中在5-6月和11-12月，见图1。年龄分布以1一12岁儿童为主，共5833例，占总病例数的68.48%，其中7一12岁儿童发病率最高，245.21/10万;其次是1一6岁组为38.14/10万，主要以学生、托幼儿童为主。3年共报告水痘突发性公共卫生事件20起，占全市突发性公共卫生事件总数的58.82%(20/34)。
　　二、VZV核酸检测及基因分型
　　Lopare、等利用ORE22的第37902,38019,38055,38081,38177,38229位这6个位点核昔酸序列的差异将水痘病毒流行株分为E,J,M3个基因型，同时又将M型分为M1和M22个亚型。本文共对32份疑似水痘患者的水疤液样本进行、的ORF`22核酸检测，结果25份样本呈核酸检测阳性。
　　获得扩增产物长度为552by的基因片段，将高亮条带的样本进行核昔酸序列测定，结果与NCBI中下载的pOKa,vOKa,CA123及Dumas株序列用DNASta:软件进行处理，比较这6个位点的差异，结果25份样本可分为2种不同基因型的毒株，其中2份样本的上述6个位点与CA123株相同，属于M1基因型株，其余23份样本6个位点均与OKA株相同，为J基因型株。但这23份J基因型株在所测定的552by核昔酸序列当中又存在一定的差异，如NB25与NB07,NB08与其他J基因型株的核昔酸序列有所不同，见表1。
　　三、病毒分离及酶切结果
　　25份核酸检测阳性样本用MRC-5细胞进行病毒分离结果有5份J基因型株样本在接种后的第4天出现成堆的细胞变大、变圆、折光增加，形成串状的细胞病变，见图2(见封三)。由于J基因毒株包括了疫苗株与野毒株，Lopare、等报道ORF62特定区域的268by序列中野毒株仅有2个限制性内切酶Sm<工酶切位点，能将这一片段切割成3个小片段，而疫苗株则有3个Sma工酶切位点，切割后为4个小片段。按此方法用ORF62基因设计的引物进行PCR扩增后，经1.5%琼脂糖电泳均获得268by的目的条带。经Sma工酶切后用4%琼脂糖电泳进行酶切分析结果，5份出现细胞病变样本的扩增产物均被Sma工切割成3片段(153,79和36bp)，显示只含2个Sma工酶切位点，而水痘疫苗对照的Sma工酶切结果为(112,79,A1和36bp)4个片段，显示含3个Sma工酶切位点，因此判断5株水痘病毒均为野生型水痘毒株，见图3.
　　讨论
　　水痘是儿童期的常见病之一，传染性强，在出疹}h}疾病中水痘的传染性仅次于麻疹，很容易在学校、幼托机构中流行〔202009-2011年的监测结果显示，宁波市水痘发病率呈逐年增多趋势，而且呈现2个季节性流行高峰，分别在每年的5-6月及11-12月，与之相反的是每年的2-3月及8-9月份出现明显的发病低谷，这正好与每年的学生寒暑假后期相吻合。发病年龄分布以7一12岁儿童发病率最高，其次是1一6岁组，成人水痘发病率较低。研究显示水痘突发事件也主要发生在小学，可能原因是，目前我国水痘疫苗接种采用1针次，7一12岁儿童水痘疫苗接种率较低，而水痘的好发人群却是以该年龄段儿童为主。学生正处于接种率低和感染率高的交叉点，疫苗接种较长时间后继发性免疫失败，而学校又是易感人群相对集中的场所，使小学生成为水痘病例的高发人群。
　　本文对水痘突发疫情中VZV的基因型别的鉴定采用直接对患者的水泡液进行ORF22第37654317这552by区域核普酸序列的测定。25份样本ORF22中，除2株为M1基因型，其余23株均为J基因型毒株，说明目前宁波市流行的主要毒株为J基因型株。但偶尔也有M1基因型毒株发现，经流行病学调查，2例M1基因型病例均为外地输人病例。
　　另外，这23份菌株仍有其他个别位点出现一些核着酸序列的不同，说明在当前本市的流行株当中，同一基因型的VZV个别基因位点也存在一定的多态性。本结果表明在突发疫情调查中采用患者水疤液直接进行VZV的ORF22第3765一4317这一区域的PCR检测法即可对VZV进行基因分型，同时也可发现一些核昔酸序列的差异，为水痘的流行病学调查提供分子生物学的依据。
　　在VZV的野生株与疫苗株的区别鉴定中本文采用Sma工对ORF62片段扩增产物进行酶切分析。由于疫苗株中有3个Sma工酶切位点，其他毒株中只有2个，若病例样本为野毒株则被Sma工切割成153,79和36bpi段，电泳后可见3个片段的条带，而疫苗株由于在上述153by的片段中多了1个Sma工酶切位点而将这一片段又切割成112和41by两个小片段，电泳后条带为4个片段。该方法准确地将OKA疫苗株和VZV野毒株区别开来，在流行病学分析中可作为判断水痘病例所感染的毒株是野毒株还是疫苗株，并且也是鉴别可能出现的疫苗反应的一种方法。虽然还有其他方法可用来鉴定，但该方法对基层单位在水痘突发性公共卫生事件调查也是一种快速、简易鉴别病原体的方法。
　　综上所述，为了有效做好水痘的防控及监测工作，应加强VZV的检测与鉴定，快速检出基因型别及区分野毒株;同时要掌握本地区VZV流行株的基因特征，分析与了解毒株的传播源头，增强监测的敏感性，为水痘防控提供可靠依据。
　　参考文献
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