一起副溶血性弧菌食物中毒的病原学检测与分析

副溶血性弧菌是夏秋季沿海地区引发食物中毒和急性胃肠炎最常见病原菌之一[1]。副溶血性弧菌通常存在于近海海水、海底沉积物、浮游生物及海产品(鱼类和贝类)中，人类多因食人未煮熟的海产品或被此菌污染的盐渍食物而感染，主要症状为腹痛、腹泻、呕吐和发热等。近年来，有关副溶血性弧菌引起的病例逐渐增多[2-5]，如不及时治疗，可能会危及牛命。针对同一血清型不同菌株进行鉴定时，传统的实验方法不能很好地进一步分型，脉冲场凝胶电泳分型( pulsed field gel electrophoresis, PFGE)具有重复性好、分辨率高[6]和易标准化等特点，是迄今最常用的亚分类方法，被广泛应用于监测细菌传染性疾病的爆发流行和追踪传染源[7]. 本研究采用传统分离技术和PFGE技术相结合，对本地区2012年5月1日发生的一次家庭婚宴中 28人食物中毒事件进行了致病菌病原学检测，以期 在分子水平揭示传染源，及时监测和控制传染源，减少食物中毒市件的发生。

1.材料与方法

1.1样品来源及材料 由青浦区食品药品监督局和接诊医院采样并及时送检。检测所用培养基、PFGE所用试剂耗材和全自动细菌鉴定分析仪(ATB Expression，法国)所用生化试剂条1D 32E均由上海申捷股份有限公司配送，有效期内使用;副溶血性弧菌Ok诊断血清购白日本生研株式会社DenkaSeiKen公司，有效期内使用。

1.2检验方法

1.2.1菌株分离与鉴定沙门菌、金黄色葡萄球菌、志贺菌、副溶血性弧菌、致病性大肠埃希菌和变形杆菌的检测分别按照GB 4789. 4-2010《食品卫生微生物学检验沙门菌检验》、GB 4789. 10-2010 《食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验、、 GB/T 4789.5-2003《食品卫生微声牡物学检验志贺菌检验》,GB/T 4789. 7一2008 《食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验》、GB/T 4789. 6 - 2003《食品卫生微牛物学检验致泻性大肠埃希菌检验》和WS/ T 9一1996《变形杆菌食物中毒诊断标雕及处理原则》中的相关要求进行。细菌的生化鉴定使用法国生物梅里埃的全自动细菌鉴定分析仪所用生化试剂条ID 32E生化板条. 1.2.2副溶血性弧菌PFGE参考美国CDC Pulse Net USA的方法。副溶血性弧菌株选用Not I酶切，参考菌株选用xba I酶切作为相对分子质量标准进行PFGE分子分型检测。

2结果

2. 1流行病学资料 2012年5月1日中午，在青浦区某社区内举办的家庭婚宴，共有3I0人参加自晚上6点开始，陆续有就餐者因腹痛腹泻等症状就诊，截至5月9日，共有28例患者就诊，主要症状表现为恶心、呕吐、腹痛和腹泻，腹泻物性状以水样便为主，个别为糊状和洗肉水样;腹痛多为上腹部和脐周阵痛绞痛个别患者血液白细胞总数升高和中性粒细胞升高。经抗生素和对症治疗，无死亡病例发生28例病例均为参加婚宴的客人，所食用的食物有虾、扇贝、鲤鱼、多宝 鱼、带鱼和石斑鱼等,72 h内均无集体性聚餐活动。 事情发生后立即采集现场样品做病原生物学检测，共采集厨师肛拭样本3件、剩余食品样本(多宝鱼、带鱼)2件，环节样本(刀、操作台面、餐具2件) 4件，患者肛拭样本16件。检测项目有沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、致病性大肠埃希菌和变形杆菌。

2. 2分离鉴定 10份患者肛拭样品和2份剩余食物样品在硫代硫酸盐一拘株酸盐一胆盐一蔗糖(TCBS)匀平板上均表现为中等大小、圆形、半透明和表面光滑的绿色菌 7} ,用接种环轻触有类似口香糖的质感;在弧菌显色培养基上为中等大小、圆形、半透明和表面光滑的粉紫色菌落;革共染色阴性，呈棒状、弧状等多形态，无芽胞 ;氧化酶试验阳性。

2.3生化鉴定结果 12株菌株经全自动细菌鉴定分析仪生化鉴定均符含副溶血性弧菌特征.主要结果如下:蔗糖(一)、葡萄糖(+)、甘露醇(+)、乳糖(一)、硫化氢(一)、赖氨酸脱梭酶(一)、V-P(一),ONPG(一)、赖氨酸 (+)、精氨酸(一)、马氨酸(+)、明胶(+) ,酶 (+),D一纤维二糖(一)、L -阿一拉伯胶糖(+),D- 甘露醇(+)和42°生长试验(十)。

2.4血清凝集试验 12株副溶血性弧菌经O,K抗原血清分型，血.清型均为04;K8。

2.5 PFGE:分型 用PFGE对12株副溶血性弧菌进行分子分型，经过NotI酶切PFGE电泳后得到3种PFGE带型通过BioNumerics软件的数据化及处理分析得到 12株副溶血性弧菌的聚类关系树(图1)。其中2株食物中毒患者菌株与食品样(带鱼)菌株具有相同带型(带型代码为M16N11. SH0596,图1中紫色部分)， 7株食物中毒病患者菌株与食品样(多宝鱼)菌株具有相同带型(带型代码为K16N 11. SH0594 ,图1中绿色部分)，另有1株食物中毒患者菌株与上述两带型均不相同(带型代码为K16N11. SH0595，图1中白色部分)。K16N11. SH0594与K16N11. SH0596两种带型有4个条带差异，k16N11. SH0595与上述两种带型(k16N1 I . SH0594 , Ik16N1 I . SH0596)之间均只有2 条条带的差异.

3讨论

在本次食物中毒事件中，从剩余食品和患者肛拭样本中分离出副溶血性弧菌，血清型均为U4;K8, 未检出其他致病菌。传统检验只能检测出L2株副溶血性弧菌，不能进行同源性分析，通过PEGE全基因DNA指纹图谱分析，对分离出来的12株副溶血性弧菌进行分子分型和聚类性分析，得到3种带型， 2株食物中毒患者菌株与带负菌株具有相同带型， 7株食物中毒病患者菌株与多宝鱼菌株具有相同带刑，两型之间只有4个条带的差异，另外1株食物中毒患者菌株与上述两带型均不相同，但只有2条电泳条带的差异，根据文献判断标准[8]提示.这些菌株在分子水平具有高度同源性，结合流行病调查结果，患者具有共同暴露和共同发病的特征，患者的典型临床症状可以判断该起事件是由这种PFGE型别副济血性弧菌污染带鱼和(或)多宝鱼而引起的暴发 2006-2007年上海市食品中致病菌监测结果显示:市售水产品中副溶血性弧菌的检出率为5.6%9，该菌也是[海地区集体性食物中毒的首要致病原。 2004-2011年上海市集体性食物中毒资料[11]调查显示，查明18起婚宴食物中毒的致病原均为副溶血性弧菌。 市民举办婚宴主要有两种方式:一种是在宾馆饭店举办，另一种为家庭自办。婚宴高峰期一般在每年的5一10月，菜谱中多有海产品，一旦加工过程中出现生熟交叉污染、一锅烧煮量太大或烧制时间不足等，则极易发生由副溶血性弧菌污染而引起的食物中毒。

目前，针对集体食堂和饮食服务单位(宾馆等)的监管已经在逐步加强[12]，但对于家庭式聚餐的监管还比较薄弱。基于目前家宴越来越多的情形一方面要加强预防食物中毒的宣传教育工作，另 、方面要进一步落实家宴申报管理制度。