人参茎叶皂苷对毛囊间充质干细胞增殖的影响

毛囊间充质干细胞是从毛囊乳突部分离出来的一种可周期性增殖、分化，具有自我更新和较强增殖并修复相邻部位损伤能力的成体干细胞。人参(Panax ginseng C.A.Meyer)为五加科(Araliaceae)人参属(Panax)多年生草本植物[1]。人参是一种名贵中药，具有大补元气、复脉固脱、补气益肺等功效。人参花、人参果、人参须、人参叶中含有大量的人参皂苷，其中人参叶的皂苷含量比根还要高，值得研究和进一步利用。现代药理研究表明人参皂苷具有抗肿瘤、消除自由基、抗衰老等作用。本实验主要研究人参茎叶皂苷对毛囊间充质干细胞增殖的影响，为拓展人参茎叶皂苷的临床作用提供理论依据和实验基础。

1　材料和方法

1.1　材料

1.1.1　细胞来源

成人毛囊分离的毛囊间充质干细胞(吉林大学病理生物学教育部重点实验室)

1.1.2　仪器

倒置显微镜，荧光显微镜，酶标仪，流式细胞仪，细胞培养箱

1.1.3　试剂

DMEM-F12(GIBICO)，青霉素(华北制药)，链霉素(山东鲁抗医药)，胎牛血清(Hyclone)，胰酶(GIBICO)，MTT，人参茎叶皂苷(吉林大学化学教研室)，DMSO(进口分析纯)，EDTA，BSA，人成纤维细胞生长因子(hbFGF)(Pepro Tech)，Rabbit polyclonal to PCNA-Proliferation Marker(Abcam)，Anti-Rabbit IgG(H+L)， F(ab’)2 Fragment(Cell Signal)

1.2　方法

1.2.1　绘制标准曲线

24孔细胞培养板，细胞浓度依次是1000、2000、4000、6000、8000、10000个每孔(每个细胞浓度四个复孔)。大多数细胞贴壁后加入80μL MTT溶液，置CO2培养箱中孵育4h后吸出培养液和MTT，用PBS洗两次后加入400μLDMSO将MTT反应后的物质洗脱下来，溶解15 min后，吸出200μL上清加到96孔板，酶标仪检测(需预热3min)各孔吸光度A值。(DMSO作空白调零孔)

1.2.2　细胞加药

用含10ng/mL bFGF的DMEM-F12培养液培养至70-80%时传代，然后用无bFGF的基础培养液培养7d，接入24孔细胞培养板，每孔2000个细胞，每个给药浓度四个复孔。含10ng/mL bFGF 10%FBS培养液培养的细胞为阳性对照组，含10%FBS培养液培养的细胞为阴性对照组，给药组为实验组。人参茎叶皂苷的浓度为2.5μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL。细胞给药后，每隔两天换液，培养7天。在第8天加80μL/孔 MTT 溶液置细胞培养箱中孵育4h后弃掉上清液，缓冲液清洗细胞表面2次，加入400μL/孔 DMSO充分溶解15 min。从每个孔中取出200μL上清加入96孔板，酶标仪检测吸光度A值(DMSO作为空白调零孔)。

1.2.3　流式细胞仪检测给药后细胞周期

细胞传代，3×105个每皿(皿的直径为10cm)。根据MTT结果，选择人参茎叶皂苷最佳给药浓度为12.5μg/mL,10ng/mL bFGF 10%FBS培养液为阳性对照组，10%FBS培养液为阴性对照组，12.5μg/mL人参茎叶皂苷为给药组。每两天换一次液，培养4d，第5d收集细胞，PBS洗涤，离心;弃掉PBS,1mL -20℃预冷的70%的乙醇4℃过夜固定，再次离心，PBS洗涤;弃掉PBS后加100μL 50μg/mL的RNA酶轻混后，置37℃细胞培养箱30min;避光加入500mL PI染色液，混匀，4℃避光处理30min;上机检测。

2　结果

2.1　标准曲线

用24孔板铺板，加入MTT溶液作用后用DMSO溶解后转移至96孔板再上机检测。取平均值绘制标准，结果见图1。图1　细胞生长标准曲线

2.2　人参茎叶皂苷不同给药浓度筛选

将人参茎叶皂苷的给药浓度设定为2.5μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL，实验中阳性对照组为含有10ng/mL bFGF的培养液，阴性对照为无bFGF的基础培养液。不同浓度的人参茎叶皂苷给药培养毛囊间充质干细胞7天后，采用MTT法检测细胞增殖，结果显示当人参茎叶皂苷浓度为12.5μg/mL时，相对于阴性对照组和阳性对照组其对毛囊间充质干细胞的促增殖作用最强。图2　不同浓度人参茎叶皂苷对毛囊间　充质干细胞的促增殖作用

2.3　流式细胞仪检测细胞周期

选择12.5μg/mL的人参茎叶皂苷浓度为实验组，以含10ng/mL bFGF的DMEM-F12培养液作为阳性对照组，无bFGF的DMEM-F12的基础培养液作为阴性对照组，培养毛囊间充质干细胞。用流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期。检测结果表明，人参茎叶皂苷培养毛囊间充质干细胞中处于G2期、M期和S期的细胞百分数明显多于阴性对照组，而与阳性对照组相当，说明细胞处于增殖活跃阶段，因此认为12.5μg/mL人参茎叶皂苷对毛囊间充质干细胞具有明显的促增殖作用。下图中A1、B1为人参茎叶皂苷组、A2、B2为bFGF阳性对照组、A3、B3为无bFGF的基础培养基阴性对照组。图3　人参茎叶皂苷组、bFGF阳性对照组、　无bFGF阴性对照组细胞周期

3　讨论

干细胞是一种具有无限自我更新能力、同时也可分化成特定组织的细胞，分为成体干细胞和胚胎干细胞。毛囊干细胞是成体干细胞中的一种，具有分化多潜能性，慢周期性，自我更新能力强等特点，在体外可诱导成表皮细胞、神经元细胞、神经胶质细胞[2]。

研究结果表明一些中药有效成分对毛囊或毛发具有促进作用，可用于脱发的治疗。人参促进毛发生长的机制，可能是通过减少退行期毛囊内细胞凋亡而延长毛发的生长期[3,4]。细胞周期主要包括细胞间期和细胞分裂期;细胞间期又分为DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)三个时期[5]，其中DNA合成期和DNA合成后期细胞处于增殖阶段。本实验采用MTT法、流式细胞仪等方法检测分析各组细胞的增殖，结果表明人参茎叶皂苷在12.5μg/mL时促进毛囊间充质干细胞增殖作用与10ng/mL的人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)相当;与阴性对照组相比差异显著。毛囊间充质干细胞是毛囊里面的主要细胞之一，可分化发育成毛发，因此，人参茎叶皂苷可通过促进毛囊间充质干细胞增殖而促进毛发生长发育，在开发毛发修复和养发护发产品方面具有广阔的应用前景。

【参考文献】

[1]　国家药典委员会编. 中华人民共和国药典I部[S]. 北京： 化学工业出版社， 2005： 7-8.

[2]　Kobayashi K， Rochat A， Barrandon Y. Segregation of keratinocyte colony-forming cells in the bulge of the rat vibrissae[J]. Proc N atl Acad Sci USA， 1993， 90 (15)： 7391-7395.

[3]　赵玉磊， 范卫新. 中药黄芪、女贞子、人参促毛发生长的在体研究[J]. 临床皮肤科杂志，2003， 32(6)： 321-322.

[4]　赵玉磊， 范卫新. 黄芪、女贞子、人参混合煎剂对化疗后脱发影响的实验研究[J]. 南京医科大学学报(自然科学版),2004， 24(3)：305-306.

[5]　翟中和， 王喜忠， 丁明孝. 细胞生物学[M]. 2000： 358-360.