胞外microRNA 的生成与转运机制研究进展

MicroRNA(miRNA)是一类长约22bp 的小分子非编码单链RNA。作为一类基因表达调控分子，绝大多数miRNA存在于细胞内，通过与靶mRNA 的3′非翻译区(3′UTR)互补结合而介导抑制mRNA 的翻译，从转录后水平参与基因表达调控。除作为胞内基因表达调控分子之外，近年研究发现，血清、血浆、唾液和尿液等细胞外体液中也稳定地存在着大量的miRNA，是为胞外miRNA。其中，血清、血浆中的miRNA被称为循环miRNA，其异常表达与肿瘤等疾病密切相关，因此可能成为一类新型的疾病诊断或预警生物标志物。近年来，人们提出了多种关于胞外miRNA 生成及转运的可能机制。　

1　胞内miRNA 的被动释放研究表明，细胞损伤、凋亡或组织坏死时，能直接导致细胞内miRNA 被动释放进入血液循环，因此成为可能反映组织损伤的分子标志物。例如，有多位学者研究了肝脏损伤时循环miRNA 表达的变化，其中Bala等[1]检测了慢性丙型肝炎病毒感染患者血清以及外周血单核细胞中的miR122、miR155、miR146a和miR125b的含量，发现miR122和miR155表达水平升高与炎症性肝细胞损伤程度呈正相关;其中，血浆miR122可能是肝细胞损伤而释放，而丙型肝炎病毒感染患者血清中miR155表达升高可能由免疫细胞释放和肝细胞损伤共同导致。Wang等[2]基于药物诱导肝损伤模型，发现小鼠血浆中miR122和miR192的表达水平显著升高，说明肝细胞损伤能够直接导致细胞内miRNA 被释放至血浆中，其灵敏度高于传统的谷丙转氨酶(ALT)，对此，Starkey等[3]推测miR122的释放可能分两个阶段：早期由能量依赖的转运，随后则是大量细胞坏死后泄漏。在研究急性心肌梗死(AMI)时，Li等[4]发现早期AMI时心脏特异表达的miR1，miR133a，miR208b和miR499 表达即显著上调。Ai等[5]亦发现，AMI患者血浆中miR1 的表达水平显著高于对照组，并且用药后恢复至正常。鉴于miR1在心肌中含量丰富且特异表达，认为AMI患者血液循环中miR1显著升高源于坏死的心肌细胞的直接释放。除此之外，miRNA 亦能由死亡的肿瘤细胞释放进入血液中。例如，Roth等[6]提到凋亡或坏死的肿瘤细胞除能释放DNA 和RNA，还能够释放miRNA 进入循环中。

2　胞内miRNA 的主动释放途径

2.1　经微囊泡(MVs)的主动分泌　MVs包括外泌体和脱落囊泡(SVs)，其中，外泌体(直径40～100nm)包含在微囊泡小体(MVBs)中并通过质膜融合的胞吐作用产生并释放至胞外;脱落囊泡(直径小于1μm)是由微囊泡的质膜直接出芽产生并被释放进入循环中;微粒(MPs)则是来源于血小板和单核细胞等细胞的脱落囊泡[7]。通过100000×g超高速离心，人们从体液或细胞培养上清中能够分离出MVs。研究表明，MVs中的内容物包括脂质、mRNA、miRNA 和蛋白质等，而且几乎所有类型的细胞都能主动分泌出包裹有miRNA 的膜性囊泡至细胞外。进一步研究发现，大多数MVs 中的miRNA 与Ago2 蛋白(1 种miRNA介导的基因沉默复合体的功能蛋白)结合，说明这些与Ago2结合的miRNA 是具有功能活性的[89]，因此，MVs膜性囊泡中的miRNA 可能发挥类似激素或旁分泌作用的基因表达调控分子而发挥生物学功能。多项实验证实，miRNA 能被许多类型的细胞包裹进入外泌体、微囊泡和凋亡小体等脂质性囊泡中，加入去污剂破坏脂质性囊泡结构后将导致囊泡内RNA 被迅速降解[10]。有学者认为，血清中可检测到的大部分miRNA 被包裹于MVs内，而且MVs对miRNA 的转运具有十分重要的作用。Skog等[11]发现，将MVs暴露于RNA 酶A的环境时，MVs内RNA 含量仅下降7%，提示大部分RNA 都包裹在MVs中从而免受RNA 酶降解;Gallo等[12]将新鲜和冻存的人血清及唾液超速离心后分离外泌体，检测发现血清和唾液中大部分miRNA 存在于外泌体中;但也有学者通过分子筛层析色谱技术和免疫沉淀法，检测到大部分循环miRNA 并非存在于MVs内，而是与Ago2蛋白结合形成Ago2miRNA 复合物而稳定存在于血液循环中[89]。已有研究发现，MVs能够以其表面蛋白分子作为配体而靶向性地向受体细胞转运具有活性的蛋白质、mRNA、miRNA等[13]。Zhang等[14]证实THP1 单核细胞和巨噬细胞的MVs能将FITC 标记的外源性miR150 转运至培养的HMEC1 内皮细胞，从而下调HMEC1 细胞cMyb 基因表达并且增加HMEC1细胞的迁移，近一步实验表明，静脉注射THP1 源性MVs能明显提高小鼠体内循环miR150 的含量，而动脉粥样硬化患者的血浆中的MVs 中含有大量的miR150。Jing等[15]随后证明，以MVs为转运载体，单核细胞分泌的miR150可作用于内皮细胞而促进新生血管生成，因此也提供了一种基于miRNA 的新的疾病治疗思路。Ismail等[16]研究发现，巨噬细胞源性MVs中包含的miR223等miRNA 能够转运到单核细胞、内皮细胞、上皮细胞以及成纤维细胞中发挥相应的生物学功能。Gidlf等[17]认为血小板内源性miRNA 需经囊泡的形式才能有效释放并转运到内皮细胞中，研究发现，荧光标记的miRNA 和外源性线虫miRNA 能够经由活化血小板被高效的转运到内皮细胞系内，当加入brefeldinA(血小板微粒释放抑制剂)后，miRNA 的转运能完全被抑制，因此说明miRNA 的释放具有囊泡依赖性。业已表明，血小板包含有大量且多样的miRNA，血小板源性的MPs也是循环系统中最丰富的MVs。Laffont等[18]亦证实，激活的血小板能够释放出包含有miRNA 等生物活性物质的膜性微粒并转运到受体细胞中发挥生物效应。

2.2　经外泌体的主动分泌　外泌体是一种大小均一、直径约为40～100nm 的囊性小体[7]，存储于晚期核内体的多囊泡小体内，通过与细胞膜融合而释放。当细胞受到刺激时，发生核内体出芽，此过程受钙内流、钙蛋白酶和细胞骨架重构以及鞘磷脂酶2 (nSMase2)活性的调控。其中，作为神经酰胺合成的限速酶，nSMase2控制着外泌体的释放[19]。外泌体含有大量的miRNA，Valadi等[20]曾首次报道外泌体可将细胞内miRNA 转运至细胞外循环及受体细胞内发挥作用。借助COS7和HEK293细胞，Kosaka等[10]证实，miRNA 可通过一种神经酰胺依赖的分泌机制释放，当nSMase2 被抑制剂或小干扰RNA 抑制时，miRNA 的分泌明显减少，而nSMase2的过表达可使胞外miRNA 含量增加。Gibbings等[21]提出，miRNA 装载进入外泌体可能是并不是一个随机事件而是受RNA 诱导的沉默复合物(RISC)的特殊蛋白控制的选择性过程，而nSMase2可能是决定因素之一。Valadi等[20]发现肥大细胞源性的外泌体运载有121种不同的miRNA，其中一些miRNA 在外泌体中的含量相对其源细胞更高，据此推测miRNA 借助一种主动选择机制进入外泌体中。Yang 等[22]发现荧光素标记的外源性miRNA 能够从IL4激活的巨噬细胞“穿梭”到共培养但并未有直接接触的乳腺癌细胞中，促进共培养的SKBR3和MDAMB231细胞显著增殖、侵袭，而从巨噬细胞释放的外泌体中能够检测到巨噬细胞特异性miR223，当采用反义寡核苷酸(ASO)抑制miR223后，共培养的乳腺癌细胞的侵袭性减低，因此说明巨噬细胞源性外泌体介导了具有致癌作用的miR223在细胞间的转运。Ohshima 等[23]发现胃癌细胞株AZP7a源性外泌体其富含Let7 族的miRNA，可能在胃癌细胞克隆形成和转移中发挥重要作用。Levenan等[24]在哮喘患者和健康对照的支气管肺泡灌洗液的外泌体中均检测到了miRNA 的存在。Pegtel等[25]证实，外泌体miRNA 能够促进病毒感染，通过EB病毒感染的B细胞与未感染的树突状细胞的共培养，发现EB病毒miRNA(EBVmiRNA)通过外泌体的转运而积聚，并且影响与其共培养的未感染细胞CXCL11 基因的表达。Ohno等[26]研究证实外泌体在体内可将抗肿瘤的miRNA 转运至乳腺癌细胞，并据此提出外泌体可作为药物传送系统的载体。Wang等[27]证实B 细胞、T 细胞、树突状细胞(DC)的外泌体含有不同的miRNA。Montecalvo 等[28]认为，DC 之间的相互作用可能够通过外泌体穿梭miRNA 而介导。

2.3　经凋亡小体主动释放途径　细胞凋亡是一种由基因控制的细胞有序自主死亡过程，凋亡小体是细胞凋亡时经细胞膜内陷而将细胞自行分割成多个外有膜包裹、内容物不外泄的小体，直径约为0.5～2.0μm[29]。现已发现，在发生动脉粥样硬化时，凋亡小体被释放到循环中。Zernecke等[30]在小鼠动脉粥样硬化的动物模型中，发现由凋亡小体运载的miR126能向血管受体细胞传递旁分泌信号而诱发CXCL12 的产生，从而抑制动脉粥样硬化而发挥保护血管作用。

2.4　经脱落囊泡释放途径　在细胞生物学中，囊泡指一类体积相对较小的细胞内囊状构造，这些囊泡外围由至少1层的脂质双层分子膜构成，用来存放、消化或传送物质。据文献[7]报道可将直接从质膜出芽的直径小于1μm 的囊泡均归结为脱落囊泡，可来源于神经细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、血小板、单核细胞和树突状细胞等，在Ca2+ 等刺激下，静息细胞也可产生脱落囊泡。微粒(MPs)是一种可归类于脱落囊泡的膜性小体。如前所述，血小板源性MPs是血液循环中含量最丰富的MPs，因此也是循环miRNA 的重要载体之一[17]。基于对THP1细胞和HUVECs细胞进行二代测序及对血小板源性MPs进行qRTPCR，Diehl等[31]发现MPs中miRNA 的表达水平与其母体细胞截然不同，受刺激和未受刺激的母体细胞MPs中的miRNA 表达水平也有显著不同，据此认为miRNA 进入MPs的过程是一个主动包裹的过程。

3　HDL 介导的miRNA 转运最近发现，作为胆固醇逆向转运的载体，高密度脂蛋白胆固醇(HDL)还是miRNA 转运载体之一[32]。与人工基因运载工具类似，天然HDL 能作为血浆中循环miRNA 的载体或仓库，并依赖于B类I型清道夫受体促进内源性miRNA 向受体细胞的转运。实验显示，人类血浆HDLmiRNA 复合体的表达水平在家族性高胆固醇血症患者和健康对照的人群显著不同，而且HDL 介导的miRNA 的转运也受nSMase2和神经酰胺依赖途径调控。前文述及[10]，nSMase2 的过表达和神经酰胺途径的激活能够诱导外泌体的释放以及miRNA 的转运。而与之相反，HDL 介导的miRNA 的转运是随着nSMase2 的水平增高而受到抑制。因此，nSMase2 的表达高低或许是miRNA 选择通过外泌体分泌还是通过HDL 结合转运的分支点[32]。在计算HDLmiR 占总循环miRNA 池的百分比时，Wagner等[33]发现miR126、miR378、miR223相比于其他miRNA能更为有效的与HDL 结合，说明HDLmiRNA 的结合具有特异性;另外，与HDL 结合浓度最高的miR223 仅占总循环miRNA 的8%，表明大多数循环miRNA 并非与HDL 相关联，而且，HDL 相关miRNA 并未被内皮细胞、平滑肌细胞及外周血单核细胞有效的摄取，其生物功能尚待进一步研究。

4　Ago2介导的miRNA 转运形式研究表明，经过蛋白酶K 处理后，miRNA 对RNA 酶极其敏感。前文提到[89]，大多数血浆miRNA 与Ago2蛋白结合而得到保护。Turchinovich 等[9]利用超速离心法和蛋白免疫印迹法证实细胞外miRNA 是非囊泡来源，并与Ago2 蛋白相关联的，其以Ago2蛋白miRNA 复合物的形式稳定存在于细胞外间隙。进一步研究发现[34]，血浆miRNA 主要是与Ago1和Ago2相关联的。然而，除miR222 主要是与Ago1 相关联而存在，其余Ago1 中miRNA 的含量均显著低于Ago2。Li等[35]证实在细胞分泌的MVs中，Ago2蛋白复合物和MVs分别为miRNA 提供了特异性和非特异性的保护作用，借助miR16探针及免疫共沉淀，确定Ago2是miR16 的一个主要的相关蛋白，而且，相对于裸露的miR16，Ago2 相关的miR16 对RNA 酶的耐受呈现剂量和时间依赖性，而当miR16/Ago2复合物被吖啶黄破坏后，miR16对RNA 酶的耐受力降低。类似的相互关系还体现在miR223/Ago2 复合物中。Guduric等[36]发现特异的内源性miR451可选择性通过Ago2 相关的途径释放并转运。最近，Xu等[37]研究发现一种由神经元细胞轴突末端分泌并主动释放的非囊泡性Ago2 相关的miRNA，去极化能够刺激miRNA 通过胞吐作用分泌，其作用类似于神经递质的释放。

5　展　　望胞外miRNA 尤其是循环miRNA 作为一种潜在的疾病诊断或预警生物标志物已经备受关注，而阐明miRNA 的释放及转运机制对于理解并发现有价值的miRNA 作为疾病生物标志物极为重要。目前，人们已经发现一些可能作为疾病诊断、预警及预后标志物的循环miRNA，然而，细胞内源性miRNA分泌或释放到细胞外的途径复杂多样，目前来看，尚难以将miRNA 的分泌、转运方式完全归结于某一种特定途径，随着更为有效的数据挖掘办法的应用，借助采取“组”学和“谱”学的研究方法，有助于推进miRNA 作为生物标志物的应用研究。

参考文献

[1] BalaS，TilahunY，TahaO，etal.IncreasedmicroRNA155expressionintheserumandperipheralmonocytesinchronicHCVinfection[J].JTranslMed，2012，10(1)：151.

[2] WangK，ZhangS，MarzolfB，etal.CirculatingmicroRNAs，potentialbiomarkersfordruginducedliverinjury[J].ProcNatlAcadSciUSA，2009，106(11)：44024407.

[3] StarkeyLewisPJ，MerzM，CouttetP，etal.Serum microRNAbiomarkersfordruginducedliverinjury[J].ClinPharmacolTher，2012，92(3)：291293.

[4] LiYQ，Zhang MF，Wen HY，etal.Comparingthediagnosticvaluesofcirculating microRNAsandcardiactroponin Tinpatientswithacutemyocardialinfarction[J].Clinics(SaoPaulo)，2013，68(1)：7580.

[5] AiJ，ZhangR，LiY，etal.CirculatingmicroRNA1asapotentialnovelbiomarkerforacutemyocardialinfarction[J].Biochem BiophysResCommun，2010，391(1)：7377.

[6] RothC，RackB，MüllerV，etal.CirculatingmicroRNAsasbloodbased markersforpatients with primaryand metastaticbreastcancer[J].BreastCancerRes，2010，12(6)：R90.

[7] CocucciE，RacchettiG，MeldolesiJ.Sheddingmicrovesicles：artefactsnomore[J].TrendsCellBiol，2009，19(2)：4351.

[8] ArroyoJD，ChevilletJR，KrohEM，etal.Argonaute2complexescarryapopulationofcirculatingmicroRNAsIndependentofvesiclesinhumanplasma[J].ProcNatlAcadSciU S A，2011，108(12)：50035008.

[9] Turchinovich A，WeizL，LangheinzA，etal.CharacterizationofextracellularcirculatingmicroRNA[J].NucleicAcidsRes，2011，39(16)：72237233.

[10]KosakaN，IguchiH，YoshiokaY，etal.Secretorymechanismsandintercellulartransferof microRNAsinliving cells[J].J BiolChem，2010，285(23)：1744217452.

[11]SkogJ，WürdingerT，vanRijnS，etal.GlioblastomamicrovesiclestransportRNA andproteinsthatpromotetumourgrowthandprovidediagnosticbiomarkers[J].NatCellBiol，2008，10(12)：14701476.

[12]GalloA，Tandon M，AlevizosI，etal.ThemajorityofmicroRNAsdetectableinserum andsalivaisconcentratedinexosomes[J].PLoSOne，2012，7(3)：e30679.

[13] Ahmed KA，Xiang J.Mechanisms ofcellularcommunicationthroughintercellularproteintransfer[J].JCellMolMed，2011，15(7)：14581473.

[14]ZhangY，LiuD，ChenX，etal.Secreted monocyticmiR150enhancestargetedendothelialcellmigration[J].MolCell，2010，39(1)：133144.

[15]LiJ，ZhangY，LiuY，etal.MicrovesiclemediatedtransferofmicroRNA150from monocytestoendothelialcellspromotesangiogenesis[J].JBiolChem，2013，288(32)：2358623596.

[16]IsmailN，WangY，DakhlallahD，etal.Macrophagemicrovesiclesinduce macrophage differentiation and miR223 transfer[J].Blood，2013，121(6)：984995.

[17]GidlfO，vanderBrugM，OhmanJ，etal.PlateletsactivatedduringmyocardialinfarctionreleasefunctionalmiRNA，whichcanbetakenupbyendothelialcellsandregulateICAM1expression[J].Blood，2013，121(19)：39083917.

[18]LaffontB，CorduanA，PléH，etal.ActivatedplateletscandelivermRNA regulatory Ago2omicroRNA complexes to endothelialcellsviamicroparticles[J].Blood，2013，122(2)：253261.

[19]ZampetakiA，WilleitP，DrozdovI，etal.ProfilingofcirculatingmicroRNAs：from singlebiomarkerstorewired networks[J].CardiovascRes，2012，93(4)：555562.

[20]ValadiH，Ekstrm K，BossiosA，etal.ExosomemediatedtransferofmRNAsand microRNAsisanovelmechanism ofgeneticexchangebetweencells[J].NatCellBiol，2007，9(6)：654659.

[21]GibbingsDJ，CiaudoC，ErhardtM，etal.MultivesicularbodiesassociatewithcomponentsofmiRNAeffectorcomplexesandmodulatemiRNAactivity[J].NatCellBiol，2009，11(9)：11431149.

[22]Yang M，ChenJ，SuF，etal.Microvesiclessecretedbymacrophagesshuttleinvasionpotentiating microRNAsintobreastcancercells[J].MolCancer，2011，10(1)：117.

[23]OhshimaK，InoueK，FujiwaraA，etal.Let7microRNAfamilyisselectivelysecretedintotheextracellularenvironmentviaexosomesinametastaticgastriccancercellline[J].PLoSOne，2010，5(10)：e13247.

[24]LevnenB，BhaktaNR，TorregrosaParedesP，etal.Altered microRNAprofilesinbronchoalveolarlavagefluidexosomesinasthmaticpatients[J].J Allergy ClinImmunol，2013，131(3)：894903.

[25]PegtelDM，CosmopoulosK，ThorleyLawsonDA，etal.FunctionaldeliveryofviralmiRNAsviaexosomes[J].ProcNatlAcadSciUSA，2010，107(14)：63286333.

[26]OhnoS，TakanashiM，Sudo K，etal.SystemicallyinjectedexosomestargetedtoEGFRdeliverantitumormicroRNAtobreastCancercells[J].MolTher，2013，21(1)：185191.

[27]WangJ，WangL，LinZ，etal.MoreefficientinductionofantitumorT cellimmunity byexosomesfrom CD40L genemodifiedlungtumorcells[J].MolMedRep，2014，9(1)：125131.

[28]MontecalvoA，LarreginaAT，Shufesky WJ，etal.Mechanism oftransferoffunctionalmicroRNAsbetween mousedendriticcellsviaexosomes[J].Blood，2012，119(3)：756766.

[29]CreemersEE，Tijsen AJ，PintoYM.Circulating microRNAs：novelbiomarkersandextracellularcommunicatorsincardiovasculardisease[J].CircRes，2012，110(3)：483495.

[30]ZerneckeA，BidzhekovK，NoelsH，etal.DeliveryofmicroRNA126byapoptoticbodiesinducesCXCL12dependentvascularprotection[J].SciSignal，2009，2(100)：ra81.

[31]DiehlP，FrickeA，SanderL，etal.Microparticles：majortransportvehiclesfordistinct microRNAsin circulation[J].CardiovascRes，2012，93(4)：633644.

[32]VickersKC，PalmisanoBT，ShoucriBM，etal.MicroRNAsaretransportedinplasmaanddeliveredtorecipientcellsbyhighdensitylipoproteins[J].NatCellBiol，2011，13(4)：423433.

[33]WagnerJ，Riwanto M，BeslerC，etal.Characterizationoflevelsandcellulartransferofcirculatinglipoproteinbound microRNAs[J].ArteriosclerThrombVascBiol，2013，33(6)：13921400.

[34]TurchinovichA，BurwinkelB.DistinctAGO1andAGO2associatedmiRNAprofilesinhumancellsandbloodplasma[J].RNABiol，2012，9(8)：10661075.

[35]LiL，Zhu D，HuangL，etal.Argonaute2complexesselectivelyprotectthecirculating microRNAsincellsecreted microvesicles[J].PLoSOne，2012，7(10)：e46957.

[36]GuduricFuchsJ，O′ConnorA，CampB，etal.SelectiveextracellularvesiclemediatedexportofanoverlappingsetofmicroRNAsfrom multiplecelltypes[J].BMCGenomics，2012，13(1)：357.

[37]XuJ，Chen Q，Zen K，etal.Synaptosomessecreteanduptakefunctionallyactive microRNAs via exocytosisand endocytosispathways[J].JNeurochem，2013，124(1)：1525.

(收稿日期：20131108)