用携有存活蛋白基因的重组腺病毒载体转染树突状细胞诱导细胞毒T细胞抗淋巴瘤免疫效应

作者                     作者单位

朱雄鹏   福建医科大学附属泉州第一医院, 泉州 362000

陈志哲   福建医科大学附属协和医院, 泉州 362000

胡建达   福建医科大学附属协和医院, 泉州 362000

李纯团   福建医科大学附属泉州第一医院, 泉州 362000

杨婷　　 福建医科大学附属协和医院, 泉州 362000

Abstract This study was purposed to investigate the immunological effects of modified dendritic cells (DCs) in inducing cytotoxic T cells (CTLs) effect against lymphoma cells. The DCs were derived from human peripheral blood and transfected with recombined adenovirus vector carrying survivin gene, Western blot was used to detect the expression of survivin, the lactate dehydrogenase (LDH) release test was used to determine the cytotoxicity of CTLs, the mixed lymphocyte reaction (MLR) was used to measure the ability to proleferate allolymphocyte by DCs, ELISA was used to assay IL12 level in supernatant. The results showed that the expression of survivin in transfected dentritic cells was confirmed by Western blot analysis. In MLR assay, DCs transfected with Adsurvivin could induce higher allogeneic lymphocytes reaction at the ratios of 1∶5,1∶10,1∶50 and 1∶100. DCs transfected with Adsurvivin had much higher activity of CTL to CA46 cells than control DCs. The levels of IL12 of supernatants containing DCs transfected with Adsurvivin were significantly higher than that in the control group. It is concluded that DCs transfected with Adsurvivin can induce CTL response in vitro against lymphoma cells.

Key words survivin gene; dendritic cell; CA46 cell line; lymphoma; cytotoxic T cell; immunotherapy

J Exp Hematol 2007; 15(3):591-593

树突状细胞(dendritic cell, DC)作为机体内功能最强的专职抗原呈递细胞(APC)，在激活T细胞介导的免疫反应中起关键性作用，而survivin(存活蛋白，SVV)基因是肿瘤组织较为特异的基因，其编码的蛋白survivin成为肿瘤较理想的靶抗原之一。因此，我们以重组腺病毒介导SVV基因修饰DC，观察诱导产生的特异性抗淋巴瘤免疫效应，为以DC为基础肿瘤免疫治疗提供实验依据。

材料和方法

材料

表达survivin蛋白的重组腺病毒(AdSVV)由本所构建、包装[1]，滴度为： AdSVV 2.65×109pfu/ml;恶性淋巴瘤细胞株CA46为本室保存株。总蛋白裂解酶、蛋白酶抑制剂为美国Pierce公司产品;兔抗人survivin多克隆抗体为北京中杉生物技术公司产品;辣根标记山羊抗兔IgG、Westernblotting lunimol试剂(ECL)为Santa Cruz 公司产品。Cytotox96 NonRadioactive Cytotoxicity Assay试剂盒购自Promega公司。细胞因子IL12检测试剂盒购自深圳晶美生物公司。

中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(3)转染存活蛋白基因的树突状细胞抗淋巴瘤免疫的研究 DC的分离、培养和病毒感染

人外周血DC的分离和培养参照文献[1]，收集培养第7天的DC，按MOI为100加入重组腺病毒，分为3组： 转染AdSVV的DC组(AdSVV DC)、空载体转染DC组(AdCMVDC)和未转染DC组(NDC)，并补充生长因子GMCSF、IL4(终浓度均为1 000 U/ml)。于37℃ 5% CO2，培养箱继续培养48小时 (第9天)收集细胞。

Survivin蛋白表达的Western blot鉴定

收集第9天转染AdSVV的DC组和空载体转染DC组的DC，进行蛋白质抽提，SDSPAGE电泳，Western blot鉴定外源基因SVV蛋白的表达[1]。

同种混合淋巴细胞反应(MLR)测定

取培养第9天的AdSVVDC和NDC，分别加入丝裂霉素C，使其终浓度为50 μg/ml，在37℃，5% CO2的培养箱中培养45分钟，作为刺激细胞。分别以2×104/孔、1×104/孔、2×103/孔、1×103/孔将DC加入96孔板中，以T淋巴细胞供者自身的PBMC为对照组，每组设3个复孔。每孔均加入1×105的T淋巴细胞，刺激反应细胞之比(S/R)分别为1∶5，1∶10，1∶50，和1∶100，终体积200 μl，于37℃，5% CO2的培养箱中培养96小时。终止培养前4小时加入MTT 20 μl(5 mg/ml)，培养终止后加DMSO 200 μl，充分混匀后静置。选择波长为570 nm处测OD570值。计算刺激指数(SI)，结果以3孔的均值表示。

刺激指数(SI)=实验孔OD均值/对照孔OD均值

CTL细胞体外杀伤活性的检测

效应细胞的制备 取培养第9天的AdSVVDC组细胞和NDC组细胞各5×105，作为刺激细胞，加入到24孔培养板中，按5×106/孔加入经T细胞尼龙毛柱分离的T淋巴细胞(反应细胞);同时以不与DC共孵育的自体淋巴细胞为对照，每组设3个复孔。加入IL2(500 U/ml)，于37℃、5% CO2的培养箱培养。以后隔天半量换液，并补充IL2，继续培养至第14天，作为效应细胞。

CTL的活性测定 以1×104∕孔加靶细胞(CA46)到96孔板中，再分别按5∶1、10∶1、20∶1(效应细胞∶靶细胞)加效应细胞到各孔中，每组设3个复孔。同时设4个对照:靶细胞最大释放组、体积校正对照组、背景对照组和自然释放组。按Cytotox96 NonRadioactive Cytotoxicity Assay试剂盒说明书检测CTL反应，以对靶细胞的杀伤率表示CTL活性。

细胞杀伤率(%)= [(实验组释放-效应细胞自发释放-靶细胞自发释放)/(靶细胞最大释放-靶细胞自发释放)]×100%

细胞因子的检测

收集培养AdSVVDC以及NDC的当天、第2天、第4天上清，按试剂盒说明书方法进行IL12含量检测。

统计学处理

本实验数据应用SPSS 11.5 统计软件进行方差分析。

结 果

存活蛋白的表达

经 Western blot检测，转染AdSVV的DC在16.5 kD处可见一阳性条带(附图)，提示经基因转导的DC可有效表达SVV蛋白，而未转导基因的DC未检出SVV蛋白表达。

Figure . Expression of SVV protein detected by Western blot. M: marker. Lane 1: AdCMVtransfected DC. Lane 2: AdSVVtransfected DC.

刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力

在不同的S/R(刺激细胞/应答细胞为1∶5、1∶10、1∶50、1∶100)比值时，转染AdSVV的DC与未转染的DC比较，具有更强刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力(P<0.01)。

CTL杀伤活性的检测

在效靶比(E/T)为5∶1、10∶1和20∶1时，转染AdSVV的DC(AdSVVDC)所诱发的CTL活性均值分别为23.48%、38.24%和46.76%，未转染的DC(NDC组)诱发的CTL活性为7.32%、8.83%、14.72%，两组间的CTL活性有显著性差异(P<0.05)。对照组在E/T为5∶1、10∶1和20∶1时未检测到CTL活性。

细胞因子的检测

在转染病毒后第2天、第4天，AdSVVDC组和NDC组的IL12分泌水平分别为50.7±3.2 pg/ml和56.4±2.7 pg/ml及36.5±1.8 pg/ml和42.3±2.6 pg/ml。AdSVVDC组的IL12分泌水平高于NDC(P<0.05)。对照组上清中未能检测到IL12。

讨 论

非霍奇金淋巴瘤(NHL)的发病率及死亡率均有上升趋势，传统治疗难以彻底消灭肿瘤细胞，因此如何进一步提高疗效并最终根治本病，已成为目前研究的热点和难点。近年来，对树突状细胞在肿瘤抗原呈递和肿瘤免疫中重要作用的揭示, 开拓了肿瘤免疫治疗的又一新领域。肿瘤疫苗即肿瘤的特异性主动免疫治疗，近年来取得了可喜进展，其中尤以DC疫苗的进展最为瞩目[2,3]。

Survivin基因是一个抗凋亡基因,它在大多数肿瘤组织中表达，而在正常成人组织中不表达。业已证明，HL60、K562、CA46、U266等血液肿瘤细胞系均高表达survivin[4，5]。因此，应用靶向survivin的免疫治疗有望成为一种重要的抗肿瘤疗法。Schemitz 等[6]将自身DC与可溶性重组survivin共培育，诱导出survivin特异性的CD8+ CTL，首次证实了survivin可作为一种潜在应用价值的肿瘤疫苗抗原。

本实验用重组腺病毒介导SVV基因转染DC，通过检测证实DC能够表达SVV抗原蛋白，转染后成熟DC仍具有较强刺激同种异体T淋巴细胞增殖和分泌细胞因子的能力。此研究结果说明Ad能够高效介导目的基因感染DC，重组腺病毒不影响DC的成熟及其功能，是目前基因治疗研究中较为理想的载体。

在研究靶细胞毒性实验中，我们应用CytoTox 96 非放射试剂盒测量乳酸脱氢酶(LDH)在细胞裂解后的释放量，结果表明转染survivin基因的DC在体外能诱导特异性CTL，杀伤淋巴瘤细胞。这提示用重组腺病毒载体介导survivin基因的DC疫苗可能是抗淋巴瘤治疗中有效的方法。

【参考文献】

1朱雄鹏，陈志哲，林旭等. 存活蛋白重组腺病毒载体的构建及其在树突状细胞的表达. 中国实验血液学杂志，2006; 14：791-794

2Steinman RM, Cohn ZA. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med, 1973;137: 1142-1162

3Banchereau J, Briere F, Caux C, et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol.2000;18:767-811

4Zeis M, Siegel S, Wagner A， et al. Generation of cytotoxic responses in mice and human individuals against hematological malignancies using survivinRNAtransfected dendritic cells. J Immunol, 2003; 170: 5391-5397

5薛军,林茂芳. survivin 基因在血液肿瘤细胞株的表达. 中华血液学杂志, 2004: 25:375-376

6Schemitz M, Diestelkoetter P, Weigle B, et al. Generation of survivinspecific CD8+ T effector cells by dendritic cell pulsed with protein or selected peptides. Cancer Res, 2000; 60:4845-4849