尼古丁对人牙周韧带细胞的生物学活性的影响

作者                         作者单位

朱建华   佳木斯大学附属第二医院牙周黏膜科，黑龙江 佳木斯 154002

王泽     佳木斯大学附属第二医院牙周黏膜科，黑龙江 佳木斯 154002

邹庆雪   黑龙江省林业卫生学校口腔教研室，黑龙江 佳木斯 154007

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

尼古丁成品(上海晶纯试剂有限公司);二甲基亚砜(DMSO,Sigma，USA);塞唑蓝(MTT,Sigma，USA);超净工作台(杭州恒宇净化设备厂);电热恒温培养箱(上海福玛实验设备有限公司);台式高速离心机、超高速离心机(美国Backman公司);GF-M3000酶标仪(山东高密彩虹分析仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 取材

征得患者同意将因正畸需要拔除的健康年轻恒牙(拔除前按常规将牙冠及冠周以碘伏消毒，年龄12～22岁)，置于含双抗的4℃ Hanks液中，离体后1h之内送达实验室处理。无菌条件下，刮取根中三分之一牙周膜，用镊子将组织块置于一次性培养瓶中同时加入1mL培养液浸润组织块。

1.2.2 牙周韧带的原代培养

将上述培养瓶倒置放于恒温培养箱(37℃，5%CO2)，2h后翻转培养瓶补加1mL培养液。24h后小心加液至5mL，防止冲起组织块。培养液为20%胎牛血清，100μg/mL青、链霉素的高糖DMEM培养基，细胞游出前每5天换一次液，细胞游出后每3天换一次液。

1.2.3 尼古丁培养液的配制

用含1%胎牛血清的DMEM完全培养基分别配制含尼古丁的培养液，尼古丁浓度分别为63.4μg/L(低浓度)、126.8μg/L(中浓度)、253.6μg/L(高浓度)[1]。

1.2.4 尼古丁对人牙周韧带细胞增殖的影响

取对数生长期第3代人牙周韧带细胞，0.25%胰酶消化，计数，稀释，以3×105个/mL接种于96孔板内，每孔100μL，培养箱标准环境下培养24h，使其贴壁，更换含1%FBS的DMEM培养液培养24h，使细胞同步化，弃培养液，PBS洗2次，分别加入含低、中、高浓度尼古丁的1%胎牛血清的DMEM培养液200μL，培养24h，每孔加入噻唑蓝溶液20μL培养4h，弃去孔内液体，每孔分别加入DMSO 150μL，震荡10min，酶标仪490波长下测定每孔光密度值(OD)。

1.3 统计学分析

实验数据运用SAS 6.12软件包处理，P<0.05，有显著意义。

2 结果

2.1 形态观察

用组织块法获得的原代细胞(A)，贴壁细胞形态较均一，为长梭形，细胞排列紧密，呈漩涡状生长。随尼古丁浓度的增加细胞形态变椭圆或圆形，细胞出现间隙逐渐失去梭形细胞形态。在63.4μg/L的浓度范围尼古丁对牙周韧带细胞的形态无明显影响(B):细胞伸展良好，呈梭形的细长外观。当浓度达到126.8μg/L和253.6μg/L时(C、D)，呈现明显的细胞毒性效应，细胞形态改变:细胞皱缩，变圆，伸展差，不贴壁，呈悬浮状态。如下图所示。

2.2 不同浓度尼古丁对人牙周韧带细胞增殖影响

研究结果显示，在加入尼古丁24h后，各浓度的尼古丁实验组均能抑制人牙周韧带细胞的生长，各实验组与对照组比较均有显著性差异P<0.05，其中高浓度尼古丁组对细胞的抑制作用明显强于低浓度和中浓度组。说明在本研究所选的浓度范围内，尼古丁对人牙周韧带细胞的生长呈抑制作用。

3 讨论

牙周韧带细胞是牙周韧带中的主要细胞，具有趋化黏附、增殖、生物合成和分化为成骨细胞、成牙骨质细胞，分别形成于牙槽骨、牙骨质等多种生物学功能，对牙齿支持组织的维持、再生和损伤修复起极其重要的作用。尼古丁有毒性、无色和易挥发，具有水溶性，易溶于水形成水溶性盐。很多研究表明[2]，给予不同剂量的尼古丁，特别是啮齿类动物可显示其有害作用。本研究利用体外培养的正常人牙周韧带细胞为实验对象，通过倒置显微镜观察细胞形态，利用MTT分析方法测定尼古丁对细胞增殖的影响。结果表明，尼古丁能抑制体外培养人牙周韧带细胞的增殖。尼古丁抑制细胞增殖的原因可能有:①与其抑制细胞增殖的效应有关，能使处于增殖状态的活细胞阻滞与G2/M，无法进入下一个增殖周期，使牙周韧带丧失自我修复能力。②可能与尼古丁抑制各种酶的活性有关，导致细胞生长未同步。牙周膜细胞是一个具有多种功能的异质性细胞群，包括成纤维细胞，成骨细胞，成牙骨质细胞和未分化的间充质细胞等。其中未分化的间充质细胞具有多向分化潜能，推测在尼古丁的刺激作用下，可抑制分化成牙周组织再生所需的多种细胞，如成纤维细胞，成骨细胞和成牙骨质细胞等。因此将牙周韧带细胞作为靶细胞，研究尼古丁对其影响，明确尼古丁对牙周组织再生和修复中具有的毒害作用，对有效预防和治疗牙周疾病将起到积极作用。

【参考文献】

[1]郑明祺，龚旭龄.烟碱毒理学与吸烟[J].中国药物依赖性杂志，1998,7(2):7276

[2]王小竞，文玲英，杨富生，等.尼古丁对牙乳头间充质细胞增殖的抑制作用[J].实用口腔医学杂志，2000,16(5):369371