增殖细胞核抗原反义寡脱氧核苷酸调节脐血CD34+造血前体细胞体外扩增和分化的时间效应

作者             作者单位

李回军  汕头大学医学院第一附属医院血液科

吴映娥  汕头大学医学院第一附属医院血液科

林莎丽  汕头大学医学院第一附属医院血液科

曾宇然  汕头大学医学院第一附属医院血液科

刘元生  汕头大学医学院第一附属医院血液科

Time Effect of Proliferating Cell Nuclear Antigen Antisense Oligodeoxynucleotide　on the Expansion and Differentiation of Umbilical Cord Blood CD34+ Hematopoietic Precursor Cells in vitro

LI Hui_jun, WU Yinge, LIN Sha_li, ZENG Yu_ran, LIU Yuan_sheng

(Department of Hematology, The First Affiliated Hospital, Shantou University Medical College, Shantou 515041, China; Clinical Laboratory, The First Affiliated Hospital, Shantou University Medical College, Shantou 515041, China; Department of Obstetrics, Shantou Maternity and Child Healthcare Hospital, Shantou 515041, China)

[Abstract]Objective: To study the time effect of low concentration proliferating cell nuclear antigen antisense oligodeoxynucleotide(PCNA_ASODN)on the expansion and differentiation of umbilical cord blood CD34+　hematopoietic precursor cells in vitro. Methods: CD34+　cells were purified from fresh umbilical cord blood by immunomagnetic beads, and incubated in liquid culture system with low concentration PCNA_ASODN which added into the culture system at different time. Using flow cytometry, the number of different kinds of stem/progenitor cells and cell cycle were detected after CD34+　cells incubated for 7 days. Results: The umbilical cord blood CD34+ hematopoietic precursor cells in the experimental group were obviously expanded, especially in the 72 hours group. The percentage of CD34+　cells in the 72 hours group was increased to(35.6±1.8)%, CD34+CD38-　cells were expanded(55.1±4.2)folds, and(49.8±2.5)% cells were in G0/G1 phase. Conclusion: Low concentration PCNA_ASODN has the time effect on the expansion of CD34+　cells, and reduces its differentiation when CD34+　cells are expanded in vitro.

[Key Words]proliferating cell nuclear antigen antisense oligodeoxynucleotide; hematopoietic precursor cell; expansion in vitro

近年脐血干细胞移植在治疗血液肿瘤和骨髓衰竭综合征方面取得了巨大成就，但由于单份脐血所能获得的造血干/祖细胞数量有限,限制了其在临床的广泛应用。脐血前体细胞的体外扩增是解决这一难题的有效途径之一，但扩增的同时不可避免地伴随细胞的分化成熟,从而影响了其重建长期造血的能力。如何在扩增造血前体细胞的同时尽可能地保留其自我更新能力和多向分化潜能，成为当前另一个研究热点。研究表明,造血前体细胞的增殖分化过程不但受控于细胞因子,同时与细胞周期调控因子密切相关[1,2]。增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)是重要的细胞周期调控蛋白,在造血细胞增殖发育过程中也发挥重要作用[3]。本研究旨在不同时间段通过反义核酸技术调控PCNA在脐血CD34+细胞中的表达,探索PCNA_反义寡脱氧核苷酸(Antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)调节脐血CD34+细胞体外扩增和分化的时间效应，寻找PCNA_ASODN作用的最佳时间点，使脐血CD34+细胞在体外扩增的同时能延缓其分化进程,以期达到更好地扩增效果。

1 资料与方法

1.1 脐血采集和分离

选择健康孕妇、足月顺产胎儿5例(均来自汕头市妇幼保健医院产科),用一次性采血袋(规格200mL,内含25mL　CP2DA抗凝剂)采集脐血样品5份。平均采血量55～80mL,样品在采集6h内分选。细胞悬液经体积分数0.6%的ACD_A缓冲液稀释,聚蔗糖_泛影葡胺(相对密度1.077)梯度离心。收集界面层单个核细胞(MNC),洗涤备用。

1.2 CD34+细胞分离纯化

采用miniMACS磁珠分选系统进行分选，所用分选试剂盒为直接CD34祖细胞分选试剂盒(Miltenyi Biotec公司，德国)。标记细胞通过置于磁场中的分离柱,洗脱除去CD34-细胞,将分离柱移出磁场,加压洗脱,收集CD34+细胞,锥虫蓝染色检测其活力,流式细胞仪检测其纯度及CD34+CD38-细胞的百分比，所用标记抗体为CD34_FITC(Miltenyi Biotec公司，德国)、CD38_PE(eBioscience公司，美国)。

1.3 PCNA_ASODN合成

PCNA_ASODN(上海生工生物工程有限公司合成)保存在-20℃冰箱中，其序列:5′>GACCAGG_GGCGCCTCG_AA<3′。

1.4 实验分组

IMDM培养基中含体积分数20%胎牛血清(FCS),加入造血生长因子(μg/L):细胞因子浓度分别为重组人Flt3_配体50、重组人干细胞生长因子50、重组人血小板生成素50、重组人白细胞介素_3 20、重组人白细胞介素_6 20,总体积1mL。分4组培养:对照组(未加PCNA_ASODN)、实验1组(于第48h转染PCNA_ASODN)、实验2组(于第72h转染PCNA_ASODN)、实验3组(于第96h转染PCNA_ASODN)。将分选出的CD34+细胞按(1～2)×105/mL接种于24孔培养板,每孔1mL,置于体积分数5% CO2、37℃饱和湿度的CO2孵箱中培养7d,在培养第3d半量换液1次。在培养第7d收集细胞,加入固定剂固定,4℃冰箱保存,准备流式细胞仪(Beckman Coulter公司,美国)检测。

1.5 阳离子脂质体介导的PCNA_ASODN转染

分别于第48、72、96h收集相应实验组的培养细胞，计数细胞后，按每4×105细胞数加入1μg PCNA_ASODN∶2μL脂质体的比例进行转染，具体步骤参考Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美国)说明书。

1.6 流式细胞仪检测

将上述固定的标本用PBS洗2次后,弃上清，每组细胞均分2管。管1中加入抗CD34_FITC抗体及抗CD38_PE抗体,混匀后室温下避光15min。管2加入RNA酶A,37℃消化30min后冰浴终止反应,加入碘化丙啶，4℃避光15min。所有样品摇匀后加入PBS液悬浮,流式细胞仪检测。

1.7 统计学处理

应用SPSS12.0统计软件进行数据分析,组间差异比较用t检验。

2 结果

2.1 脐血CD34+细胞分离纯度

利用miniMACS磁珠分选系统可以得到高纯度的CD34+细胞,流式细胞仪检测达(73.9±2.79)%,其中CD34+CD38-细胞比例为(10.3±0.73)%。

2.2 PCNA_ASODN对CD34+细胞体外扩增的影响

经体外培养7d后,转染的各实验组和对照组有核细胞数和CD34+细胞数均较培养前明显扩增。其中实验组有核细胞扩增倍数较对照组低,但CD34+CD38-细胞扩增倍数则较对照组高，尤以实验2组扩增最显著(表1)。从细胞培养结果发现,新鲜分离的脐血CD34+细胞为圆形，体积较小，呈分散状态，细胞间隙大;经培养后细胞体积增大，各实验组细胞数较培养前均明显扩增，但程度不等,细胞间隙疏密不一,其增殖程度与转染PCNA_ASODN的时间顺序成反比，依次为实验3组>实验2组>实验1组;对照组则均匀扩增，呈鹅卵石样排列(图1a～1e，封3)。

表1 PCNA_ASODN对CD34+细胞体外扩增倍数的影响(略)

Table 1 The effects of PCNA_ASODN on the folds of CD34+ cells after expansion in vitro

与对照组比 1)P≤0.01,2)P≤0.05

2.3 PCNA_ASODN对CD34+细胞体外扩增后细胞亚群的影响

分离出的脐血CD34+细胞在体外培养7d后,实验组中CD34+细胞占总细胞数的比例较对照组高，体外扩增后CD34+CD38-细胞占CD34+细胞的比例也较对照组高，且两者均以实验1组的比例最高(表2)。

表2 PCNA_ASODN对CD34+细胞体外扩增后细胞亚群的影响(略)

Table 2 The effects of PCNA_ASODN on the cell subpopulation of CD34+ cells after expansion in vitro

与对照组比 1)P≤0.01

2.4 细胞周期分析

培养前脐血CD34+细胞(92.6±3.5)%处于G0/G1期,培养7d后,由于细胞的增殖分化,细胞进入S/G2/M期明显增多。但各实验组进入S/G2/M期的细胞比例均较对照组少，以实验3组的比例减少最为显著,但实验1组与对照组比较差异无统计学意义(表3)。

表3 PCNA_ASODN对脐血CD34+细胞扩增中细胞周期的影响(略)

Table 3 The effects of PCNA_ASODN on the cell cycle of CD34+ cells after expansion

与对照组比 1)P≤0.01

3 讨论

造血前体细胞在造血细胞因子的作用下可在体外大量扩增,但扩增的同时不可避免地伴随细胞分化成熟,从而影响了其自我更新和多向分化能力的保留,影响造血干细胞移植的效果。如何在扩增过程延缓细胞分化,最大限度增加早期造血祖细胞的数量,是我们的研究目的。

细胞的增殖分化与细胞周期密切相关，PCNA是重要的细胞周期调控蛋白,其表达随细胞周期进程而变化，是促进细胞从G1期进入S期的关键因素。另外,许多细胞周期调节蛋白也通过和PCNA相互作用而影响细胞周期的进程(如CDK2、p21等)。因此,PCNA在细胞周期调控中起了重要的作用，参与细胞的增殖分化调控[4]。

反义核酸通过碱基互补原则与靶mRNA结合形成杂交双联，可通过激活RNA酶H的活性引起mRNA降解，或通过妨碍mRNA与核糖体的结合从而阻断mRNA翻译，或通过影响pre_mRNA在核内的稳定性及抑制pre_mRNA的剪切从而干扰mRNA的成熟，最终导致蛋白表达的下调,从而抑制靶基因的表达,抑制细胞的增殖[5]。反义核酸目前已被广泛用于蛋白鉴定和抗肿瘤方面的研究。同样，在体外实验中PCNA_ASODN也已用于膀胱癌和肝癌等肿瘤的治疗[6,7]。我们的前期研究已经证实新鲜分离的脐血CD34+细胞仅表达低水平的PCNA,在体外扩增过程中PCNA的表达明显增加，相应地进入S/G2/M期的细胞也明显增加[8]。而第3d加入低浓度PCNA_ASODN能通过抑制PCNA的表达,增加G0/G1期细胞所占比例，提示PCNA_ASODN能通过调节脐血CD34+细胞中PCNA的表达，影响细胞周期的进程[9,10]。本实验中，各实验组分别于不同时间段转染PCNA_ASODN，结果显示各实验组G0/G1期细胞比例均较对照组有所增加，其比例依次为实验3组>实验2组>实验1组>对照组。说明PCNA_ASODN对脐血CD34+细胞体外扩增过程中细胞周期的影响与PCNA_ASODN的作用时间呈负相关，随着PCNA_ASODN作用时间点的延迟，进入S/G2/M期的细胞比例则逐渐减少。

CD34分子是造血干/祖细胞主要的表面标志，CD34分子如果与CD38分子共同表达，提示细胞已经开始向定向祖细胞分化[11]，只有CD34+CD38-细胞才具有多能干细胞的特性，临床干细胞移植结果也证明CD34+CD38-造血前体细胞才具有重建长期造血的能力。我们的前期研究证实，在脐血CD34+细胞体外扩增过程中，CD34+细胞不可避免地发生了分化[8]。而低浓度PCNA_ASOND在调节细胞周期进程的同时也可延缓CD34+细胞的分化作用,说明PCNA_ASODN能通过调节脐血CD34+细胞中PCNA的表达，影响细胞的增殖和分化[9,10]。本实验中，各实验组CD34+细胞占有核细胞数的比例和CD34+CD38-细胞占CD34+细胞的比例均较对照组高，说明PCNA_ASODN对脐血CD34+细胞的体外增殖和分化的影响同样具有时间效应，PCNA_ASODN的作用时间越早，则CD34+细胞的分化程度越低。

本实验中，虽然随着PCNA_ASODN的作用时间点的延迟，CD34+细胞的分化程度逐渐增高，CD34+CD38-细胞的比例逐渐降低，但CD34+细胞和CD34+CD38-细胞数量的扩增倍数则依次为实验2组>实验3组>实验1组>对照组，可能是由于在脐血CD34+细胞体外扩增的早期，PCNA_ASODN作用时培养体系中的细胞总数较低，PCNA_ASODN作用后细胞增殖和分化明显受抑，因此其扩增速度也明显受抑，在短期的体外扩增过程中其扩增倍数也就明显降低。基于PCNA_ASODN影响脐血CD34+细胞的细胞周期进程和体外增殖分化的时间效应，在脐血体外扩增过程中，需选择合适的PCNA_ASODN作用时间点，才能在获得足够的细胞数的同时尽可能的获得更多的未分化或低分化细胞。我们认为本实验第72h左右是比较合适的作用时间点。

本实验结果提示PCNA_ASODN对脐血CD34+细胞体外扩增过程的调节作用具有时间效应，不同时间点作用后所获得的G0/G1期细胞比例、CD34+细胞比例以及CD34+CD38-细胞比例均不同,从而证明了在造血前体细胞体外扩增过程中,对细胞周期调控因子的干预应选择适合的时机,才能获得最好的造血前体细胞体外扩增效果。

【参考文献】

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