肠道感染中致泻性大肠埃希菌的检测及流行情况分析

　　大肠埃希菌(犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻，犈.犮狅犾犻)是人肠道中的正常菌群，其中有些菌株携带致病基因，能引起腹泻，称为致泻性大肠埃希菌(DEC)。根据DEC的致病特点和携带的致病基因大致分为：肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠出血性大肠埃希菌(EHEC)、肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)、肠聚集性大肠埃希菌(EAEC)和弥散聚集性大肠埃希菌(DAEC)等[1]。DEC是引起腹泻的常见致病菌，其致病机制与致病基因或获得性毒力质粒有关，常规的细菌培养与鉴定方法不能鉴别各种致病性大肠埃希菌，检出率较低[2]。本研究用分子生物学方法检测大肠埃希菌的10种致病基因，以了解本地区肠道感染中DEC的感染及流行情况。其中，eae、bfpa为EPEC的致病基因，LT、ST为ETEC的致病基因，ial为EHEC的致病基因，Aggr为EAEC的致病基因，draac为DAEC的致病基因，eastA为EAEC的耐热肠毒素致病基因，VT1、VT2为两种不同的VERO毒素基因片段。

　　1　材料与方法

　　1.1　标本来源　2012年1月至2012年12月收集本院急诊及肠道门诊腹泻患者粪便标本835例。

　　1.2　试剂与仪器　HE平板和营养琼脂等培养基由上海伊华公司提供，PCR引物、探针及Taq酶和dNTP等试剂均由上海赛百盛生物技术有限公司合成与提供，荧光定量PCR仪为Bio-RadIQ5。大肠埃希菌ETEC诊断血清为丹麦哥本哈根产品。

　　1.3　细菌培养鉴定　标本接种于HE平板，35℃培养18～20h，挑取单个发酵乳糖菌落转种营养琼脂，按照《全国临床检验操作规程》要求鉴定大肠埃希菌，对部分不典型菌株用API20E确认。

　　1.4　细菌核酸制备　挑取数个分纯的菌落，放入含有0.1%tritonX-100及0.5mmol/LEDTA配制溶液100μL悬浮，100℃金属浴5min，12000×g离心5min，取上清用于PCR检测。

　　1.5　PCR反应　用Premier公司Beacondesigner7.9软件获取基因编号序列，用软件选取致泻性大肠埃希菌各致病基因上下游引物和探针。PCR反应体系：Mg2+浓度为5mmol/L，上下游引物浓度为0.25μmol/L，探针浓度为0.15μmol/L，dNTPs各0.2mmol/L，Taq酶为2IU，模板为3μL，用dH2O补足总体积为30μL。PCR反应条件：37℃2min，94℃3min，1循环;94℃10s，60℃40s，40循环;60℃测定荧光值。

　　2　结　　果

　　2.1　DEC检测结果　835例腹泻患者粪便标本，经培养共检测出DEC148株，阳性率为17.7%(148/835)。其中，EAEC(Aggr阳性)14株，EPEC[eae阳性和(或)bfpa阳性]22株，DAEC(draac阳性)28株和ETEC[ST阳性和(或)LT阳性]65株，仅出现eastA阳性不能分类19株，未检出EHEC。

　　2.2　不同季节阳性菌株种类分布　6～10月DEC菌株最多，为90株，与此段时间腹泻高发相关，见图1。不同阳性菌株的检出情况也呈现季节性，EAEC在1～3月未检出，其余时间呈现散发分布;DAEC在1～3月和10～12月检出较多，5～9月未检出;EPEC和ETEC在7～9月检出最多。见表1。

　　2.3　阳性菌株分离患者年龄分布　0～13岁患者检出DEC菌株11株(EAEC2株、DAEC4株、EPEC3株、ETEC1株和仅eastA阳性1株)，阳性率10.8%(11/102);>13～60岁患者检出DEC菌株108株(EAEC9株、DAEC21株、EPEC16株、ETEC49株和仅eastA阳性13株)，阳性率20.3%(108/532);>60岁患者检出DEC菌株29株(EAEC3株、DAEC3株、EPEC3株、ETEC15株和仅eastA阳性5株)，阳性率14.4%(29/201)。

　　2.4　方法学验证结果　分别用阳性对照菌株和阴性对照菌株进行试验，阳性菌株均能得到设计预期的特异性扩增曲线，阴性对照菌株均没有得到特异性扩增曲线。

　　3　讨　　论DEC是引起腹泻的常见病原菌之一，由于形态与普通大肠埃希菌相似，传统的培养和血清凝集法检测阳性率偏低，且同一血清型下因携带不同的致病基因又可分为不同的致病类型，给临床诊断带来了困难[3-4]。近年，国内外已有学者依据不同菌株致病基因差异用分子生物学的方法来进行鉴定[6-10]，分子生物学可检测致病基因，更能反映菌株的致病情况，并且，灵敏度也高于血清学检测，因此分子生物学的方法可能会成为鉴定致DEC的常规方法。作者参考国外学者的分子生物学方法，通过设计各致病基因的PCR引物进行目的基因特异性扩增，共检出带有致病基因的DEC148株(阳性率17.7%)，其中，EAEC(Aggr阳性)14株，EPEC[eae阳性和(或)bfpa阳性]22株，DAEC(draac阳性)28株和ETEC[ST阳性和(或)LT阳性]65株，仅出现eas-tA阳性不能分类19株，未检出EHEC。本研究发现，DEC菌株检出率与季节有关，6～10月DEC菌株最多(90株)，与此段时间腹泻高发相关。不同阳性菌株的检出情况也呈现季节性变化，EAEC在1～3月未检出，其余时间呈现散发分布;DAEC在1～3月和10～12月检出较多，5～9月未检出;EPEC和ETEC在7～9月检出最多。本研究发现，DEC菌株检出率与与年龄也有一定相关性，0～13岁患者检出DEC菌株11株(EAEC2株、DAEC4株、EPEC3株、ETEC1株和仅eastA阳性1株)，阳性率10.8%(11/102);>13～60岁患者检出DEC菌株108株(EAEC9株、DAEC21株、EPEC16株、ETEC49株和仅eastA阳性13株)，阳性率20.3%(108/532);>60岁患者检出DEC菌株29株(EAEC3株、DAEC3株、EPEC3株、ETEC15株和仅eas-tA阳性5株)，阳性率14.4%(29/201)。有研究发现DEC菌株的检出情况各个地区也有不同[11-12]。分析本地区DEC菌株季节性特点和与年龄的相关性，为本地区以后的预防控制和针对性的治疗提供了可靠的依据。本研究中除了检测常用的致病基因片段，增加draac和eastA两个致病基因，eastA为EAEC的耐热肠毒素基因，不仅在EAEC中检出，在EPEC、ETEC和DAEC中也有检出，还有19株只检出eastA基因，这是因为携带致病基因的质粒可在不同菌株之间进行传递，形成新的基因组合，只带有eastA基因的菌株，可能毒力较弱，或为易感菌株，易接受质粒传递的致病基因形成感染菌株，这需要对这些菌株进一步研究。总之，DEC作为引起肠道感染的主要病原菌，现有的检测方法已不能满足临床的需要，相关部门应加强协作，使用准确、可靠的方法检测病原菌，为疾病的流行、控制、预防和治疗提供帮助。

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　　(收稿日期：2013-10-14)