日本血吸虫成虫和虫卵可溶性抗原及其组分抗原的研究

作者                   作者单位

姜旭淦　   江苏大学医学技术学院，江苏 镇江 212013

傅行礼　   中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，上海 200025

陈盛霞　   中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，上海 200025

徐会娟　   中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，上海 200025

帅连云　   中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，上海 200025

曹建平　   中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，上海 200025

仇锦波     中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，上海 200025

血吸虫为雌、雄异体, 而雌雄合抱是雌虫发育成熟的必要条件[1], 成熟的雌虫可产生大量虫卵沉积于宿主肝脏及结肠等组织, 形成虫卵肉芽肿造成组织病理损害。日本血吸虫病往往缺乏特异性临床表现, 多以病原学和免疫学检验为诊断依据。其中病原学诊断是最为经典、可靠的诊断方法, 但费时、费力, 漏检率较高。 免疫学诊断方法则受到推崇。 寻找敏感度、特异度均较高的抗原便成为血吸虫病免疫诊断技术的关键。血吸虫可溶性成虫抗原(adult worm antigen, AWA)及可溶性虫卵抗原(soluble egg antigen, SEA)成分复杂, 在实际应用时易与其他寄生虫抗原发生交叉反应而降低其特异度;单一纯化的抗原或重组抗原虽能提高免疫诊断的特异性, 但其敏感度受到影响。本研究参照本室布氏姜片吸虫纯化抗原制作方法[2]并加以改进, 采用离子交换层析法对日本血吸虫雄虫、雌虫和虫卵可溶性粗抗原进行纯化, 获得含有主要免疫成分的组分抗原, 结果满意,报告如下。

1 材料与方法

1.1 钉螺和实验动物

日本血吸虫感染的阳性钉螺由江苏省血吸虫病防治研究所提供。成年新西兰纯种白兔 2～3 kg/只, 由江苏大学实验动物中心提供。

1.2 血清

日本血吸虫病患者血清, 由湖南省血吸虫病防治研究所提供。健康人血清, 采自本校2004年入学新生体检, 经血吸虫病ELISA试剂盒检测为阴性的血清。

1.3 主要试剂

辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白 (HRPSPA，EMD Biosciences公司),硝酸纤维素膜(NC膜，孔径0.45 μm，美国Minipore公司),DE22纤维素(上海化学试剂采购供应站试剂厂进口分装品),蛋白质标志物(上海生物化学研究所产品)。

1.4 主要仪器

MZ2C台式真空浓缩仪(德国产),GENE GENIUS全自动图像分析系统(澳大利亚产),SUPER T21冷冻离心机(美国产),XL2020超声破碎仪(美国产)和岛津分光光度计(日本产)均由江苏大学检验医学研究所提供。

1.5 DE22纤维素的处理

取DE22纤维素20 g于1 000 ml蒸馏水中浸泡过夜, 溶胀后倒去上清液;加入0.5 mol/L NaOH1 000 ml, 浸泡洗涤1 h, 用3号砂芯漏斗抽滤, 并用蒸馏水洗涤抽滤至pH 7.0;加入0.5 mol/L HCl1 000 ml, 浸泡洗涤1 h, 用3号砂芯漏斗抽滤, 用蒸馏水洗涤至pH 7.0;再加入0.5 mol/L NaOH 1 000 ml, 同上处理。然后将DE22纤维素移至烧杯内, 加入磷酸盐缓冲液(PBS，pH 6.3, 0.0175 mol/L) 1 000 ml, 浸泡过夜。

1.6 日本血吸虫雌虫,雄虫和虫卵可溶性抗原及其组分抗原的制备

1.6.1 动物模型的建立和日本血吸虫雄虫、雌虫、虫卵的收集 按参考文献[3]方法, 将10只兔常规方法感染日本血吸虫尾蚴1 000条, 42 d后剖杀, 门静脉灌注法收集新鲜成虫, 立即用生理盐水漂洗3次, 分出雌、雄虫,-20℃保存备用。取兔肝, 按文献[4]方法获得纯净日本血吸虫虫卵,-20℃保存备用。

1.6.2 可溶性抗原制备 取日本血吸虫雌虫450条、雄虫320条、虫卵0.8 g, 分别在匀浆器中匀浆15 min, 超声粉碎15 min, 反复冻融3次, 于4℃ 14 000 r/min离心30 min, 其上清液即分别为日本血吸虫雌虫、雄虫及虫卵的可溶性抗原(雌虫 AWAf、雄虫AWAm、虫卵SEA)。于UV210紫外分光光度计测定光密度(D280值),分装,-20 ℃保存备用。

1.6.3 组分抗原制备 取层析管(1 cm×25 cm)3根, 将上述处理过的DE22纤维素混悬于磷酸盐缓冲液(PBS，pH 6.3, 0.0175 mol/L)中装柱，并用该PBS平衡纤维素柱, 柱床高约15 cm, 备用。取AWAm,AWAf,SEA各1.5 ml, 分别加入纤维素柱,用上述 PBS 洗脱, 流速1 ml/min, 每管收集洗脱液2 ml。测定各管D280值, 监测洗脱液蛋白含量。收集达到峰值前后D280值较高时段的洗脱液, 混合, 即为组分抗原，测定组分抗原浓度(D280值), -20℃冰箱保存备用。

1.7 SDSPAGE和Western blot(WB)分析

参照文献[5]方法进行。SDSPAGE：浓缩胶浓度为3.5%, 分离胶浓度为12.5%;每孔槽上样量为20 μl(样品蛋白浓度2 mg/ml);电泳电压100～120 V，电泳时间4 h;考马斯亮蓝染色3 h, 用脱色液(甲醇∶醋酸∶水的体积之比为5∶7∶88)脱色至本底无色。转印条件为160 mA 4℃转印10 h。 用丽春红染色, 肉眼观察转印效果。

免疫印迹主要步骤：NC膜用含0.05% Tween20的TBS (100 ml中Tris 1.21 g,NaCl 0.9 g,盐酸调节pH至7.4) 室温封闭2 h, 纵向切成宽0.3 cm膜条, 置印迹槽内。加入10份日本血吸虫病患者混合血清(用 pH 7.2， 0.01 mol/L TBS按1∶150 稀释), 室温下孵育2 h。 用TBS洗涤5次, 加HRP-SPA(工作浓度为1∶10 000), 室温下作用2 h, 同上洗涤。用4氯1萘酚底物显色, 以蒸馏水终止反应, 观察显色效果。对照预染蛋白的位置, 求出显色条带抗原的相对分子质量。

2 结果

2.1 雌虫,雄虫和虫卵组分抗原的制备

AWAm,AWAf上柱后, 用0.0175 mol/L,pH 6.3的PBS洗脱时测定, 第3～9管D280值增加, 出现单一蛋白洗脱峰。合并峰值前后D280值较高的洗脱液, 即得AWAm,AWAf组分抗原。SEA上柱洗脱时, 第3～13管D280值增加, 出现2个蛋白洗脱峰。第3～9管蛋白含量高, 为主要部分;第9～13管蛋白含量较低, 为次要部分。合并3～9管洗脱液, 即得SEA组分抗原。

2.2 AWAm,AWAf,SEA及其组分抗原的SDSPAGE结果

日本血吸虫可溶性抗原和组分抗原进行SDSPAGE, 考马斯亮蓝染色后呈现多条蛋白带, 相对分子质量(Mr)范围为14 000～170 000(图1)。以Marker蛋白的已知相对分子质量的对数和迁移率作标准曲线，测量和计算出可溶性抗原和组分抗原电泳谱带的相对分子质量。根据蛋白带的深浅划分为主带和次带。

M: 标准参照物; 1: AWAm; 2: AWAm组分抗原; 3: AWAf; 4: AWAf组分抗原; 5: SEA; 6: SEA组分抗原

图1 日本血吸虫AWAm,AWAf,SEA及其组分抗原的SDSPAGE图谱(略)

Fig 1 SDSPAGE protein pattern of AWAm, AWAf, SEA and their fraction antigens

2.2.1 AWAm,AWAf及其组分抗原的SDSPAGE结果 AWAm出现19条蛋白带, 其中Mr 97 000,70 000,57 000,52 000,43 000,40 000,38 000,37 000,28 000,25 000等显色较深, 为主带;Mr 130 000,105 000,81 000,65 000,62 000,19 000,17 000,16 000,14 000等显色较浅, 为次带。AWAf显现15条蛋白带, 其中Mr 57 000,52 000,43 000,40 000,38 000,26 500为主带，Mr 97 000,78 000,70 000,65 000,62 000,45 000,17 000,16 000,14 000为次带。雌,雄成虫有13条相同蛋白带(Mr 97 000,81 000,70 000,65 000,62 000,57 000,52 000,43 000,40 000,38 000,17 000,16 000,14 000), 但其含量有明显差别。雄虫的Mr 97 000,70 000,43 000,40 000,38 000条带蛋白含量明显高于雌虫。两性均有特异蛋白, Mr 37 000,28 000,25 000条带为雄虫特有, 而Mr 26 500仅雌虫特有。

AWAm和AWAf组分抗原电泳图谱相似, 均出现Mr 57 000,52 000,43 000,40 000,38 000,17 000,16 000,14 000等8条蛋白带, 其中Mr 17 000,16 000,14 000显色较浅, 为次带。Mr 28 000蛋白带在AWAm组分抗原中出现, 而Mr 26 500于AWAf组分抗原显现。

2.2.2 SEA及其组分抗原的SDSPAGE结果 SEA出现18条蛋白带, 其中Mr 170 000,70 000,65 000,57 000,50 000,40 000,36 000,28 000为主带，Mr 140 000,97 000,78 000,62 000,45 000,43 000,32 000,23 000,20 000,14 000为次带。SEA组分抗原显示Mr 170 000,70 000,65 000,62 000,57 000,50 000,45 000,43 000,40 000,36 000,28 000等11条蛋白带。

2.2.3 AWAm,AWAf,SEA及其组分抗原的WB结果 AWAm,AWAf,SEA及其组分抗原先进行SDSPAGE电泳，将蛋白转印到NC膜上;再将转印膜纵向切成宽膜条, 进行酶联免疫印迹(WB)，观察显色效果。对照预染蛋白的位置,判断显色条带抗原的相对分子质量(图2)。

2.2.3.1 日本血吸虫AWAm,AWAf及其组分抗原的WB结果 AWAm出现8个条带, 分别为Mr 97 000,62 000,57 000,52 000,43 000,40 000,38 000及16 000。AWAm组分抗原出现6个条带,分别为Mr 57 000,52 000,43 000,40 000,38 000及16 000。

AWAf和AWAf组分抗原WB结果相同, 显示9条带, 分别为Mr 70 000,57 000,52 000,45 000,43 000,40 000,38 000,265 000,16 000蛋白带。尽管对AWAf组分抗原进行SDSPAGE时, 未出现Mr 70 000和45 000蛋白带, WB结果仍呈阳性带。

2.2.3.2 日本血吸虫SEA及其组分抗原的WB结果 SEA中除Mr 43 000,28 000,23 000,20 000,14 000外, 均呈免疫反应阳性带。SEA组分抗原出现Mr 170 000,70 000,65 000,62 000,57 000,50 000,45 000,40 000,36 000等9条免疫反应带。

M: 标准参照物; 1: AWAm; 2: AWAm组分抗原; 3: AWAf; 4: AWAf组分抗原; 5: SEA; 6: SEA组分抗原

图2 日本血吸虫AWAm,AWAf,SEA及其组分抗原的WB结果图(略)

Fig 2 Western blot pattern of AWAm, AWAf,SEA and their fraction antigens

3 讨论

日本血吸虫病分布广泛, 危害严重, 用AWA和SEA进行免疫学诊断是血吸虫病的主要诊断方法。但是可溶性粗抗原所含组分复杂, 易与其他寄生虫病发生交叉反应, 特异性较差。研究业已表明：日本血吸虫、华支睾吸虫及并殖吸虫存在共同抗原, AWA与华支睾吸虫病患者血清进行酶联免疫印迹(EITB)反应时出现Mr 17000,17 500,38 000条带[6];华支睾吸虫成虫抗原(CSA)与日本血吸虫病患者血清EITB反应出现Mr 32 000,36 000,43 000,45 000和94 000条带[7]。张悟澄等[8]用斯氏并殖吸虫成虫抗原(PAA)ELISA检测血吸虫病急性患者血清25例、慢性36例, 交叉阳性率分别为76%和27.8%;雌虫 AWAf,雄虫AWAm,虫卵SEA用ELISA 检测68例斯氏并殖吸虫病患者血清, 阳性率为30.9%。本研究结果表明, AWAm,AWAf,SEA经SDSPAGE分析分别出现19,15和18条蛋白带, 与文献报道基本相符[3,9];AWAm和AWAf存在许多相同组分, 有13条相同蛋白带, 但其含量有明显差别, 雄虫在Mr 90 000,70 000,43 000,40 000,38 000蛋白带中, 蛋白含量明显高于雌虫;两性均有特异蛋白, 雄虫为Mr 37 000,28 000,25 000, 雌虫为Mr 26 500。高兴政等[9]亦发现日本血吸虫雄虫和雌虫抗原上的异同, 但与本文结果不完全一致, 可能与实验条件不同有关。本研究中，将AWAm,AWAf,SEA进行WB分析时分别出现8,9和13条免疫反应带, 表明并非所有蛋白均能产生免疫反应。

为了提高免疫诊断的特异性, 应提高抗原纯度, 除去不产生免疫反应以及可致非特异免疫反应的成分。以往不少学者把实验研究的焦点集中在特异性单一抗原的研究上。沈定文等[10]在血吸虫分子诊断抗原的研究中, 利用制备型SDSPAGE和电渗析方法分离纯化日本血吸虫Mr 31 000/32 000抗原(Sj 31/32), ELISA法定量检测血吸虫病患者血清抗体水平, 结果表明血清抗Sj 31/32抗体较抗AWA抗体能更好地区分不同类型的血吸虫感染, 能较好地衡量血吸虫病的感染度。舒新华等[11]对日本血吸虫重组Mr 32 000抗原(rSj 32)进行研究, 用其检测日本血吸虫病的敏感性和特异性与虫源性抗原无显著性差异。P38是血吸虫虫卵的主要抗原, 约占SEA的10%, 但曼氏血吸虫、埃及血吸虫、牛血吸虫和日本血吸虫虫卵中均含有该抗原[12]。多数研究表明, 单一的纯化血吸虫抗原能减少非特异性反应, 但敏感性和重现性却明显地受到影响。

我们曾采用离子交换层析法对布氏姜片吸虫抗原进行纯化，去除了多种非特异免疫反应的成分，获得了较好的结果[2]。本研究对原法加以改进，用DE22纤维素对AWAm,AWAf,SEA进行纯化, 得到相应非单一的组分抗原。结果显示： AWAm和AWAf两种组分抗原的电泳图谱相似, 均出现Mr 57 000,52 000,43 000,40 000,38 000,17 000,16 000,14 000等8条蛋白带。而AWAm抗原产生的 8条免疫反应带中有6条出现在AWAm组分抗原中。 AWAf组分抗原的WB结果与AWAf抗原基本相同, 均显示9条免疫反应带。SEA 13条免疫反应带中有9条出现在组分抗原。以上结果表明,组分抗原包含了粗抗原的多数免疫反应成分, 去除了众多不产生免疫反应的蛋白质, 从而获得由多种特异性高、免疫反应强、非特异性反应成分少的组分抗原, 既有很高的特异性, 又有较好的敏感性。作者认为, 组分抗原在日本血吸虫病血清流行病学调查及免疫诊断中, 有着广阔的应用前景。

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